Интервью с Dr. Annemieke Aartsma-RusLeiden University Medical Center, the Netherlands
Интервью было записано G?nter Scheuerbrandt, PhD 1 апреля 2011 года на 20th Congress of the Scientific Council of the “Deutsche Gesellschaft f?r Muskelkranke” (Немецкой ассоциации пациентов с мышечными заболеваниями) в Ulm в Germany
Вступление
Давайте поговорим о пропуске экзонов, сконцентрировавшись на клинических исследованиях с участием мальчиков с МДД этой многообещающей методики, которые, как мы надеемся, приведут к эффективной терапии для тех, кто в ней так нуждается. Но вначале скажите, пожалуйста, несколько слов о себе
С 2000 года я работаю в Leiden University Medical Center в Department of Human Genetics, где в настоящее время возглавляю работающую над пропуском экзонов группу из 10 человек. Наши усилия направлены на развитие пропуска экзонов для МДД
Клинические исследования для пропуска экзона 51
В 2004 году в интервью в Монако профессор Gertjan van Ommen, директор вашего Human Genetics Department, сказал, что пройдет по крайней мере 10 лет, пока первый экзон-пропускающий препарат будет готов для пациентов с МДД
Думаю — это правильная оценка, поскольку уже сейчас мы кое-чего достигли. Но эта оценка пока справедлива только в случае с пропуском 51 экзона. В настоящее время идет набор пациентов для клинического испытания фазы III пропуска 51-го экзона с участием 180 мальчиков с МДД. Это плацебо-контролируемое исследование, в котором мы надеемся показать, что пропуск экзонов безопасен и эффективен. Для регистрационного и маркетингового одобрения результаты исследования необходимо будет представить в регуляторные агентства (это EMEA в Европе и FDA в США), с тем, чтобы они произвели их оценку. При этом будут оцениваться многие факторы, но в основном — безопасность и эффективность. Обычно в процессе испытаний присутствуют побочные эффекты. Вопрос в том, связаны они с исследуемым препаратом или нет, и это может быть оценено путем сравнения побочных эффектов в группе плацебо и в группе, принимающей препарат.
Анализ результатов и процедура регистрации потребуют некоторого времени после окончания испытаний. После этого вы сможете закупать этот препарат для тех, кто нуждается в пропуске экзона 51?
Это станет возможным только для пациентов, которым необходим пропуск экзона 51
Клинические исследования для пропуска других экзонов
Следующим экзоном, для которого разрабатывается пропуск, будет экзон 44?
Да, пропуск экзона 44 сейчас проходит исследование фазы I/II на небольшой группе пациентов, но результаты пока не получены, т. е. мы пока не знаем, приведет ли препарат для пропуска 44-го экзона (антисмысловой олигонуклеотид, или 44-АО) к восстановлению дистрофина. Не знаем мы также пока, потребуются ли исследования фазы III
Это значит, что может быть не понадобится группа плацебо для пропуска экзона 44?
Возможно, поскольку если мы знаем, что пропуск экзона 44 приводит к восстановлению дистрофина, и если мы знаем, что восстановление дистрофина приводит к функциональному улучшению, основываясь на результатах пропуск экзона 51, встает вопрос о необходимости плацебо-контролируемого исследования для пропуска экзона 44. Если такое исследование не понадобится, припуск экзона 44 станет доступен быстрее
Эти исследования также осуществляются в кооперации между GlaxoSmith-Kline, GSK, и Prosensa?
На настоящий момент Prosensa занимается этим самостоятельно. По 51 экзону GSK и Prosensa работают совместно. На пропуск экзона 44 у GSK есть опцион
И какие следующие экзоны будут на очереди?
Prosensa готовит преклинические исследования для пропуска экзонов 45,53, а также для экзонов 52 и 55
6-минутный тест ходьбы для измерения мышечной функции
Вернемся к исследованиям пропуска экзона 51: если мы посмотрим описание деталей исследования на интернет-странице NIH, то там говорится о 6-минутном тесте ходьбы как об основном критерии оценки, об определении дистрофина не упоминается. В чем причина? Слишком трудно надежно определить дистрофин?
Препарат не может быть одобрен только потому, что имеет место восстановлении дистрофина. Одобрение препарата возможно только если есть функциональное улучшение. Функциональное улучшение может означать, что либо мальчикам станет лучше, либо что прогрессия заболевания замедляется. Для оценки функциональности существует всего несколько методов, признанных и одобренных регуляторными агентствами. 6-минутный тест ходьбы — это проверенный тест, который они готовы признать для одобрения препарата. Если бы вы хотели использовать другой тест, то должны были бы получить его одобрение, а это могло бы занять несколько лет. Таким образом, легче и быстрее использовать 6-минутный тест ходьбы
Этот тест был разработан для МДД?
6-минутный тесть ходьбы был разработан для пациентов с болезнями сердца, а не с нейромышечными заболеваниями. Компания Genzyme использовала его в процессе поиска препарата для болезни Помпе. Они первыми показали, что можно использовать этот тест в качестве основного критерия оценки для нейромышечных заболеваний. Впоследствии PTC Company из New Jersey обосновала его применение и при МДД
После проведения компанией РТС исследований их препарата Ataluren для игнорирования стоп-кодона, они опубликовали данные 6-минутного теста, проведенного в процессе исследования, и по представленным графикам можно действительно увидеть, что более низкие дозы Ataluren дают лучший эффект, чем более высокие
Что мы можем увидеть в публикации испытаний Ataluren – это что мальчикам в группе плацебо становилось хуже в течение 48-недельного исследования. Это естественное течение болезни, однако возможен эффект плацебо, и в действительности течение могло быть даже хуже. В проводимом исследовании фазы III пропуска экзона 51 мы надеемся получить на графике падающую линию с меньшим наклоном, или даже что некоторые мальчики будут сохранять свои функции, а в лучшем случае — что даже некоторым станет лучше. У нас есть некоторые дополнительные данные проводимого Prosensa исследования фазы I/II: все мальчики участвуют сейчас в расширенном исследовании, в ходе которого получают наивысшие дозы, 6 мг/кг один раз в неделю. На настоящий момент они получают терапию более 18 месяцев, и исследование будет продолжаться.
И мы знаем, что между 3 и 6 месяцем большинству из них было лучше. Но, конечно, в расширенном исследовании эффект плацебо может быть значительным, поскольку все мальчики знают, что подвергаются терапии, а также, что подвергались бы терапии только в случае восстановления дистрофина в начальном исследовании. Хотя мы не можем исключить этот плацебо-эффект, полученные данные очень обнадеживающи. Nathalie Goemans из University Hospital в Leuven, Belgium, недавно представила данные 6-минутного теста ходьбы после 48-недельной терапии, показывающие, что эффект результирующего функционального улучшения вроде бы сохраняется
Будет ли в процессе расширенного исследования проведена биопсия?
Биопсия была проведена после 6 месяцев непосредственно после испытания. Я не знаю, будут ли проведены другие биопсии. Мышечная биопсия — процедура инвазивная и довольно болезненная, так что это не то, что можно делать каждый месяц, каждые полгода или даже каждый год. Кроме того, к началу исследований у мальчиков было не так много мышечной ткани. Мы хотим ограничить биопсии, насколько это возможно.
И мышечная биопсия была бы необходима, если бы единственной целью было определение, приводит ли применение препарата к синтезу нового дистрофина и его иРНК. Однако и иРНК, и новый дистрофин довольно трудно идентифицировать. Существует множество различных тестовых процедур, в каждой лаборатории — своя разновидность таких тестов
Как я уже сказала, каждый итоговый критерий оценки утвержден для регистрационного процесса, а для разработки стандартизованных методов анализа дистрофина и иРНК потребуется много лет. Исследователи, работающие над пропуском экзонов, пытаются стандартизовать оценку уровней дистрофина, но это будет непростой задачей
Так, чтобы обойти эту проблему, мы сейчас также работаем над проектом обнаружения биомаркеров в сыворотке крови. Это проект ЕС с участием других европейских ученых. Он носит название BIO-NMD, а руководит им Alessandra Ferlini из University of Ferrara, Italy, www.bio-nmd.eu Если мы знаем, что у пациентов с МДД уровни определенных протеинов в сыворотке крови повышены, а после выработки дистрофина эти уровни снижаются, то их можно использовать в качестве искусственных маркеров. Гораздо легче брать каждые полгода немного крови для анализа, чем проводить мышечную биопсию
Клинические исследования по пропуску экзона 50
Мне известно, что AVI BioPharma сосредоточилась на пропуске экзона 50
Имеющаяся у меня информация основана на пресс-релизах. Итак, мне известно, что для пропуска экзона 50 они разработали пептид-связанный морфолиновый антисмысловой олиго. Aur?lie Goyenvalle из лаборатории Kay Davies в Oxford применяла такой модифицированный морфолиновый олиго для пропуска экзона 23 в очень тяжелой мышиной модели МДД (модельные мыши с отсутствием как дистрофина, так и атрофина) На этих мышах препарат показал себя очень хорошо и был ими хорошо переносим
Проблема состоит в том, что мы не мыши. Когда AVI протестировала то же самое на обезьянах, проявились некоторые проблемы с токсичностью. Так что я не знаю, пытаются ли они сейчас оптимизировать препарат путем изменения пептида, чтобы сделать его менее токсичным. Я не знаю, совсем ли они остановили работы по клиническому развитию пептид-связанных морфолино или только приостановили их.
Совместно с британскими исследователями, руководимыми Francesco Muntoni и Kate Bushby, AVI представила год назад другое системное исследование фазы Ib/II по пропуску экзона 51 с использованием морфолинового антисмыслового олиго, именуемого сейчас Eteplirsen. Предварительные результаты были представлены в апреле (2011 г.) на конференции American Academy of Neurology в Honolulu.
Различные типы антисмысловых олигонуклеотидов
Давайте поговорим о двух различных типах антисмысловых олигонуклеотидов, в основном используемых в проходящих клинических испытаниях.
Они имеют разный химический состав и, соответственно, разные характеристики. Используемые Prosensa/GSK составы называются 2’O-метил фосфоротиоаты, а используемые AVI — морфолиновые АОН-ы. Будучи введенными внутривенно или подкожно, они попадают в кровоток, а выводятся из организма почками. Это небольшие молекулы, настолько небольшие, что просто отфильтровываются. Это справедливо для всех АОН-ов. Преимущество 2’O-метилов в том, что их фосфоротиоатная основа связывается с сывороточными протеинами
Таким образом сывороточные протеины работают, как носители. Несвязанный АОН выводится почками, а АОН, связанный с сывороточным протеином, защищен, поэтому полупериод нахождения 2’O-метилов в сыворотке намного больше, несколько недель. Морфолины же неспособны связываться с сывороточными протеинами, так что они отфильтровываются намного быстрее. Полупериод нахождения морфолинов в сыворотке — всего лишь в пределах от 2 до 4 часов. В этом — большая разница между морфолинами и 2’O-метилами
Если вы сравните результаты исследований с морфолинами и 2’O-метилами, то увидите, что воздействие морфолинов очень локально, в то время как 2’O-метилы приводят к более однородному восстановлению дистрофина. Причина этого видимо в том, что у 2’O-метилов больше шансов проникнуть в мышцы вследствие их более долгого нахождения в сыворотке крови. Морфолины же имеют очень ограниченное «окно возможности», они либо попадают в мышцы и работают очень эффективно, либо отфильтровываются почками до того, как у них появится возможность проявить себя. Пока мы не знаем, действительно ли в этом основная причина их различий
Морфолины более дорогостоящи?
Более дорого обходится их производство, и они необходимы в более высоких дозах, поэтому они более дорогостоящи, но сейчас они не запатентованы, так что они должны стать дешевле, когда придет время их использовать
Что вы можете сказать о работе Luis Garc?a по пропуску экзонов с трансфекцией генов?
Несомненное преимущество трансфекции гена в том, что препарат, будучи введенным единожды, останется там навсегда. На настоящий момент проблема в том, что эта техника не слишком эффективна. Несмотря на то, что вы можете обработать мышцы всего тела у мыши, нужно помнить, что вес мыши всего 20 грамм. На сегодня довольно трудно обработать целую конечность человека, поскольку применяется инъекция вирусного вектора в артерию под давлением. Таким образом, первая проблема — вы не можете обработать все тело ребенка одномоментно. Генотерапия имеет и некоторые риски, поскольку если она окажется токсичной, вы не сможете это остановить. Применяя экзон-пропускающие препараты, вы можете остановить терапию, и и АОН-ы будут выведены из организма, и у вас будет возможность применить другие АОН-ы, возможно более оптимизированные. Тем не менее, если генотерапия проявит себя эффективной и безопасной, тогда конечно она должна быть более привлекательной: простая одномоментная терапия. Но пока этого нет
Пропуск экзонов для различных мутаций
Расскажите, пожалуйста, немного о пропуске экзонов для различных мутаций гена дистрофина
То, что разрабатывается сейчас — это пропуск одного экзона. Для большинства делеций в гене дистрофина требуется как раз это. Однако есть делеции, для которых необходим одновременный пропуск двух экзонов. Точечные мутации наиболее часты в экзонах out-of-frame, чем в экзонах in-frame, поскольку в дистрофиновом гене экзонов out-of-frame больше, чем экзонов in-frame. Если мутация в экзоне in-frame, то необходим пропуск только этого одного экзона. Но чаще потребуется пропуск двух экзонов, когда мутация в экзоне out-of-frame
Прим. Garry
экзоны in-frame — это экзоны, удаление которых не приводит к сдвигу рамки считывания
экзоны out-of-frame — это экзоны, удаление которых приводит к сдвигу рамки считывания
Из экспериментов на культурах клеток и животных моделях мы знаем, что одновременный пропуск двух экзонов возможен. Но пока мы не знаем, как провести клинические испытания для двух экзонов, поскольку регуляторные агентства могут потребовать бОльших исследований токсичности, либо они разрешат нам сделать коктейли из уже зарегистрированных антисмысловых препаратов. А может быть мы сможем просто делать раздельные инъекции двух АОН-ов. В этом случае процесс одобрения был бы проще, чем при использовании коктейля из АОН-ов
И пока мы не знаем, что скажут регуляторные агентства по поводу мальчиков с делециями, к примеру, экзонов с 46 по 50, которым таким образом необходим пропуск экзонов 51 и 45, которые наиболее распространены. Пропуск экзона 51 уже в разработке, а пропуск экзона 45 стоит одним из первых в приоритетном листе
Когда оба будут доступны — оба могут быть прописаны и применены. Но пока мы не знаем, как быть с пропуском двух экзонов с точки зрения регуляторных перспектив
А как исправлять дупликации?
Дупликации — это очень сложно. Проблема в том, что АОН опознает оба экзона, которые совершенно идентичны. Таким образом, если вы хотите удалить один экзон из этих двух, вы удалите их оба. Если это дупликация одного экзона, то выход есть, поскольку вы можете удалить третий экзон, расположенный ДО или ПОСЛЕ дуплицированного, восстановив таким образом рамку чтения. Но для более крупных дупликаций это становится очень сложным, и таким образом более отдаленным по реализации, однако мы над этим работаем. Так что если пропуск одного или одновременно двух экзонов для делеций и точечных мутаций может стать доступным в течение 10-15 лет, то для дупликаций это может потребовать по всей вероятности намного больше времени, а может выяснится, что пропуск экзонов для дупликаций невозможен
Пропуск экзонов для редких мутаций.
Эта временнАя оценка справедлива также для пропуска одного экзона у мальчиков с редкими мутациями?
Да, но это другая проблема, поскольку по всему миру есть более 100 очень маленьких групп пациентов с редкими мутациями. В этом случае трудно что-либо сделать, поскольку если вы захотите провести клинические испытания, пациентов так мало, что это становится статистически проблематичным.
Но проблема и в том, что большинство мальчиков с редкими мутациями, имеющими правильный диагноз, находятся в западном мире, а большинство пациентов живут в Китае и Индии. В некоторых областях этих стран диагностика и поддержка пациентов находятся на высоком уровне. Однако большинству пациентов такой уровень недоступен, у них нет диагноза, никто из них не знает о типе своих мутаций, а у многих и заболевание не идентифицировано. Думаю — это главная проблема. Теоретически в некоторых группах детей с редкими мутациями может быть более тысячи пациентов, но нам они неизвестны
Я пытаюсь заинтересовать благотворительную организацию, в которой я состою, помочь мне в получении информации педиатрами по всему миру. Посредством этого мы могли бы вступить в контакт с такими «неизвестными» семьями с Дюшенна в развивающихся странах
Думаю, это хорошая инициатива. Удивительно, что во многих странах, где вы не ожидаете, есть одна-две лаборатории, способные проводить хорошую диагностику. Недавно я была в Румынии, и узнала, что там есть лаборатория, которая делает мутационный анализ, используя современную технологию MLPA. Есть такие лаборатории и в Индии. Поскольку МДД — редкое заболевание, обычно ее диагностика производится только в одном месте страны, сопоставимой, например, с Нидерландами, а то и целого региона
Существует ли список этих лабораторий в разных странах?
В интернет существует список лабораторий, в которых вы можете провести ДНК-диагностику не только для МДД, но и для других заболеваний, для Европы такой список можно найти на www. eurogentest.org
Другие исследовательские направления
Давайте поговорим о других разрабатываемых методиках, способных помочь тем пациентам, которым не подходит методика пропуска экзонов
Да, это например Idebenone, который может способствовать качеству дыхательных мышц и сердца, а может быть — и скелетных мышц. Компания Biomarin разрабатывала препарат для апрегуляции атрофина, но прекратила его разработку, поскольку у здоровых добровольцев уровень препарата в крови был слишком мал. Этот случай вновь продемонстрировал, что если что-то дает хорошие результаты у мышей, зачастую совсем иначе действует на людей. Очень легко достичь достаточных высоких концентраций у мышей, но у людей это будет по другому. Почему? Потому что мы — не мыши. Это означает, что если что то хорошо действует на мышей, вы должны осознавать, что люди намного крупнее мышей, и сильно отличаются от них, и что большинство техник, которые работают у мышей, не работали на людях
Что касается пропуска экзонов, то GSK проводит исследование фазы III, и эти исследования покажут, будет ли эта техника работать. Если говорить о других методиках, находящихся на ранних стадиях исследований, то очень трудно сделать какие либо прогнозы, будут ли они хорошо работать. Поскольку, повторюсь, если что-то работает очень многообещающе на мышах или других животных, может не работать на людях. Над пропуском экзонов мы работаем уже более 10 лет, и все еще не достигли окончательного результата. Это показывает, что если найдено какое то многообещающее средство или техника, очень трудно предсказать, когда это станет эффективным и безопасным средством против МДД
И в завершение — трудный вопрос: стоит ли всеми имеющимися современными средствами поддержки продлять жизнь взрослым пациентам в далеко зашедших стадиях МДД с высокой степенью инвалидизации?
Думаю — это хороший вопрос. Но ответить на него сможет только один человек: сам пациент. Только пациент может решить, хочет ли он продолжать поддерживающую терапию. С нашей точки зрения ситуация, когда вы в состоянии только поднять палец или пошевелить им и двигать глазами — ужасна. Но я знаю пациентов, которые, находясь в подобной ситуации, говорят: «Моя жизнь очень ценна для меня, она мне нравится, у меня есть компьютер, я могу поехать в театр или в кино, или на футбольный матч, и я счастлив»
Думаю, если пациент счастлив и хочет жить — это его решение. Но если он говорит: «Я не хочу жить, я не хочу такой жизни» — это тоже его решение. Он взрослый, он может сам принять решение не продолжать поддержку. Здоровый дух пациента с МДД заставляет вас стыдиться своих собственных жалоб, когда вы способны ходить и делать все что угодно, а такой пациент имеет столь мало, но несмотря на это он счастлив.
Если вы оглянетесь на 20-30 лет назад — у пациентов с МДД не было поддерживающей вентиляции легких. Сейчас у них это есть, и это существенно улучшает качество их жизни, поскольку получать достаточно воздуха — для них благотворно. Улучшается не только продолжительность жизни, но и ее качество, что гораздо важнее. Так что если вы хотите получить честный и убедительный ответ на свой вопрос — спросите самих пациентов с МДД.
От имени всех семей и пациентов позвольте поблагодарить Вас за разъяснения, и за все то, что Вы и Ваши коллеги делают для поиска лечения для «наших мальчиков»
Annemieke Aartsma-Rus, PhD.
a.m.rus@lumc.nl
www.dmd.nl/gt
G?nter Scheuerbrandt, PhD.
gscheuerbrandt@t-online.de
www.duchenne-information.eu