Блоггер Авеном попробовал перевести статью об исследованиях на тему МДД, написанную немецким биохимиком Gunter Scheuerbrandt. В процессе перевода с научно-медицинского на нормальный человеческий язык, Авеном постарался убрать то, что будет интересно только специалистам.
Этот метод не является панацеей от мышечной дистрофии Дюшенна (МДД), а может помочь замедлить скорость прогрессирования болезни, делая ее похожей на доброкачественную мышечную дистрофию Беккера (МДБ), которая развивается медленнее, так как дистрофин у таких больных присутствует, но в недостаточном количестве. Методика пропуска экзонов влияет на считывание и обработку отдельного гена, в результате происходит пропуск экзонов дистрофина в мышечных волокнах, что приводит к синтезу более укороченной версии гена, структура которого становится схожей с белком характерного для МДБ. Само собой пропуск экзонов не исправит мутированный ген, но в случае применении этого метода, после того как был поставлен диагноз МДД, это позволит замедлить прогрессирующую потерю мышц, и соответственного увеличит продолжительность жизни больного.
Первое исследования метода пропуска экзонов, выполненное с участием людей, проводилось в Нидерландах с января 2006 по март 2007. В исследовании принимали участие четыре мальчика, которые уже были прикованы к инвалидным креслам. Возраст участников находился в пределах от 10 до 13 лет. Участники исследования получали лечение последовательно, назначение лечения последующему участнику исследования проводилось только после получения положительных результатов и отсутствия серьезных побочных действий у участников исследования, которые получали лечение ранее. Исследования показали, что через четыре недели введения препарата, дистрофические волокна, содержащие вновь синтезированный дистрофин в мышечных волокнах выявлялись в 64%, 85%, 97%, и 73% случаях.
Полученные результаты указывают, что лечение с использованием пропуска экзонов, при появлении возможности его использования, должно начинаться, пока большая часть мышечной ткани не захвачена патологическими изменениями, непосредственно после выявления вида мутации дистрофина.
Блокаторы миостатина.
В Берлине в 1999 году был обнаружен мальчик, обладающий большими физическими возможностями, без миостатина, скелетные мышцы которого были почти вдвое больше, чем у нормального ребенка. В теле здорового человека и среди животных, имеется белок миостатин, который блокирует гены, участвующие в образовании мышц, таким образом, миостатин ограничивает рост мышц.
Демонстрация работы миостатина (слева) и действие препарата ACE-031 (справа).
Отвлечемся на животных. Быки бельгийской голубой породы с генетическими отклонениями обладают большой мышечной массой, поскольку их ген, кодирующий миостатин, инактивируется вследствие мутации.
С подобными генетическими отклонениями встречаются также собаки породы уиппет — малая английская борзая.
Во время исследований взрослых мышей с инактивированным геном миостатина, у которых не было дистрофина и которые не могли синтезировать миостатин, было отмечено больше нормальных мышечных волокон, в меньшей степени было развитие фиброза (рубцовой ткани). У больных с МДД разрушенные мышцы заменяются рубцовой и жировой тканью, в связи с избыточным ростом соединительной ткани и ее отложением между мышцами.
Поперечное сечение мышцы, видна обширная замена мышечных волокон на жировые клетки.
В норме соединительная ткань связывает мышечные волокна, но при патологическом увеличении ее количества отмечается ригидность мышц и образование контрактур (ограничение пассивных движений в суставе). Также у мышей была заметна большая скорость регенерации мышц, чем у «нормальных» мышей с МДД, у которых не был «отключен» миостатин. Профессор Кэтрин Вагнер, в Веллстонском Центре изучения мышечных дистрофий, Университета Джона Хопкинса в Балтиморе, и его командой исследователей указывают на то, что блокирование миостатина может стимулировать регенерацию мышечных волокон у пациентов, страдающих МДД, что может замедлить темп дегенерации и даже привести к увеличению размера мышц.
Атрофин (Утрофин).
Атрофин — белок, сходный по структуре и функции с дистрофином. Встречается во многих тканях тела, в том числе в мышцах, но он располагается в нервно-мышечных, при помощи которых двигательные нервы контактируют с мембраной миоцитов. На 12 неделе эмбрионального развития мышечные мембраны содержат как атрофин, так и дистрофин, а затем атрофин исчезает, и при рождении остается только дистрофин. Таким образом, атрофин можно рассматривать как фетальную форму дистрофина.
У мышей линии mdx (животная модель МДД), у животных, у которых ген атрофина был угнетен экспериментально, и в мышцах не содержится ни дистрофина, ни атрофина, развиваются симптомы, характерные для МДД, в то время как у “нормальных” мышей линии mdx, отмечается развитие менее выраженных повреждений, несмотря на отсутствие дистрофина. Повышение количества атрофина у мышей линии mdx в три-четыре раза, в связи с использованием генетических технологий, которые не могут быть применены у человека, может предотвратить развитие симптомов дистрофии или значительно уменьшить их выраженность. У пациентов с МДД атрофин начинает поступать из нервно-мышечных соединений в мышечные мембраны, и чем больше атрофина у пациента, тем длительнее период прикованности к инвалидному креслу. Это означает, что, положительная регуляция гена атрофина может использоваться для лечения МДД.
Регенерация мышц.
Есть такая небольшая аквариумная рыбка данио рерио. Примечательна она тем, что ее используют в биологии как модельный объект для исследований. У нее есть одна очень интересная особенность — если ей удалить фрагмент сердечной мышцы, рыбки становятся несколько менее активными, однако менее чем за месяц сердце полностью восстанавливается.
Данио рерио.
Мышечные клетки (показаны зеленым цветом) сердца данио спустя 7 дней после начала опыта (слева), 14 дней (в центре), и 30 дней (справа) (фото Jopling et al./Nature).
Еще одна деталь, ее мальки развиваются очень быстро. За сутки они проходят те стадии развития, которые эмбрион человека — за три месяца. Эта особенность позволила ученым наблюдать за теми генами, которые участвуют в процессе развития организма. Ведь именно они отвечают и за наследственные заболевания.
Продолжается проведение дополнительных скрининговых тестов с использование данио страдающих дистрофией, для выделения препаратов для лечения МДД. Эмбрионы данио очень маленького размера (2-3 мм), легко транспортируются, для их полного развития требуется 24 часа. Их мышечные ткани могут легко просматриваться и анализироваться под микроскопом в поляризованном свете. Патология мышц (измененная структура) у эмбрионов с отсутствием дистрофина сходна со структурой у пациентов, страдающих МДД. После оптимизации, одно из наиболее активных действующих веществ, SMT C1100, приводит к восстановлению функции мышц мышей линии mdx, вследствие значительного снижения выраженности их дегенерации, фиброза, замещения жировой тканью и хронического воспаления. После ежедневных инъекций в течение 28 дней, побочных эффектов не отмечалось. Если доклинические токсикологические и производственные исследования будут успешными, в 2008 году планируется начало исследований безопасности с участием здоровых добровольцев, с последующим проведением в 2009 году исследований с участием пациентов, страдающих МДД.
Трансфекция генов
Специально для тех, кто интересовался, почему нельзя вводить синтезированный белок дистрофина больному. Этот метод как раз про это. При помощи аденовирусной векторной системы вводят модифицированный ген дистрофина или атрофина пациентам.
Внутривенные инъекции высокоминиатюризированного гена дистрофина восстанавливают мышечную структуру и функциональность у мышей. Инъекции гена дистрофина в мышцу руки оценены как безопасные и хорошо переносимые у шести мальчиков с МДД, планируется дополнительное исследование с участием трех мальчиков с применением более высоких доз.
Введение гена дистрофина с использованием вирусных векторов.
Введение модифицированного гена дистрофина с использованием аденовирусов (ААВ) в качестве векторов (переносчиков генов) в мышечные клетки является одним из подходов к лечению МДД. Успешные эксперименты на мышах и собаках, страдающих дистрофией, оказали помощь в разработке препарата Biostrophin™ биологической наночастицы компанией Asklepius в Чапел Хилл, Северная Каролина, вектора ААВ, серотипа 2.5 сначала для клинических исследований этого метода генетической терапии. Эти достаточно небольшие вирусные частицы теряют способность к раздражениям в клетке, поскольку большинство их генов удалено. В результате этого освобождается место для последовательностей терапевтического гена, размер которого не должен превышать 5,000 пар оснований. Трансфекция такого микрогена не приводит к излечению МДД, а только трансформирует заболевание в более доброкачественную форму Беккера с более мягким течением. Ожидаемая длина нового дистрофина, встречающегося при МДБ приблизительно равна трети длины нормального белка. В 1990 году данная форма укороченного дистрофина была выявлена в мышечной ткани у 61-го летнего пациента, страдающего МДБ, который сохранял способность ходить. Результаты использования метода сходны с лечением, основанным на пропуске экзонов, его действие связано с видом мутации. После завершения разработки метода трансфекции гена будет возможно его использование для лечения всех пациентов, страдающих МДД.
Однократное введение ААВ вектора 6 или 8 типа, обеспечивающего синтез микро-дистрофина во временно блокированный кровоток нижней конечности мыши линии mdx, приводило к выработке микро-дистрофина в более чем 80% волокон мышц нижней конечности и значительному улучшению их функции, которое отмечалось до одного года.
Эти эксперименты повторялись на макаках, морфологическое строение тела которых было сходным со строением тела маленьких детей. Но эти животные не страдали дистрофией, поскольку могли синтезировать собственный дистрофин. Векторы окрашивались зеленым флуоресцентным белком, это искусственная метка, которая легко определяется по флуоресцирующему свечению. Результаты снова были обнадёживающими: 60 — 80% волокон в мышцах нижних конечностей содержали зеленый флуоресцирующий белок.
Получив положительные результаты исследований на мышах и обезьянах, исследователи начали подготовку к так называемым вводным исследованиям или исследованиям Ib Фазы с участием мальчиков, страдающих МДД, начало которых запланировано на 2008 или 2009 год. Ожидается, что изучаемая методика с введением препарата в региональный кровоток, позволит мальчикам, которые участвуют в исследовании, дольше сохранять способность ходить, чем при отсутствии лечения, что значительно улучшит качество их жизни.
Введение гена атрофина с использованием вирусных векторов.
Профессор Джордж Карпати с сотрудниками Университета МакГилл, в Монреале, Канада, вводили целый ген атрофина, с использованием аденовирусной векторной системы, в переднюю большеберцовую мышцу новорожденных и взрослых мышей линии mdx. После этого, в 58% волокон в мышцах, в которые вводился препарат у новорожденных мышей и в 35% волокон мышц взрослых мышей, содержался атрофин, который располагался в мембранах вблизи мест, в которых у здоровых животных находится дистрофин. Белки дистрофин-ассоциированного комплекса восстанавливаются на срок до одного года. Новый атрофин в клеточных мембранах предотвращает развитие некроза (дистрофическое повреждение) в мышцах, в которые выполнялись инъекции у новорожденных мышей, и останавливает его в мышцах здоровых мышей линии mdx. Физиологические тесты показали улучшение функции всей мышцы, в которую выполнялась инъекция. Поскольку атрофин встречается в норме в нервно-мышечных соединениях, образование нового атрофина не вызывает иммунного ответа. Однако, повышенное в ходе лечения количество атрофина у взрослых, но не у новорожденных мышей, со временем, снижалось. Этот факт указывает на необходимость максимально раннего начала генетического лечения, если его использование у детей будет возможно, у пациентов, страдающих МДД.