Внесение в клетку чужеродного генетического материала является одним из основных условий успешной генотерапии. Разрабатывается множество способов трансфекции, но все они относительно неэффективны и цитотоксичны, а определение наиболее подходящего метода для каждой экспериментальной цели трудоемко и дорого.
Основные методы внесения чужеродных генов в клетки разделяются на биологические, химические и физические. Биологический метод осуществляется интеграцией генетического материала с помощью ретровирусных или аденоассоциированных векторов, первый неэффективен in vivo и несет риск инсерционного мутагенеза, а второй стимулирует иммунный ответ и не подходит для продолжительной экспрессии. При химический методе – применение катионных носителей (липосом или полимеров) – число доставленных в клетку генов составляет несколько сотен тысяч, а используемые соединения токсичны. Физические методы – это электропорация и микроинъекция, основным недостатком которых является повреждение клеток. Некоторыми группами также разрабатывается внесение ДНК с помощью стеклянных игл и dip-pen нанолитографии. К сожалению, существующие методы внесения генов не обеспечивают безопасной генотерапии и точного анализа единичной клетки.
Группа исследователей из нескольких институтов и университетов Токио предлагают метод малоинвазивной доставки гена с помощью наноиглы кантилевера и атомно-силового микроскопа, которая может проникнуть в ядро клетки, не причиняя ей значительных повреждений и не вызывая сигналов апоптоза.
Плазмидная ДНК, содержащая ген GFP, была адсорбирована на поверхности наноиглы диаметром 200 нм и длиной 6 мкм, модифицированной поли-L-лизином. Затем модифицированная игла внедрялась в ядро мезенхимной стволовой клетки человека (hMSC) или клетки эмбриональной почки человека (HEK293).
Эффективность такого внедрения рассчитывалось по количеству ДНК, доставленной в каждую клетку, которое оценивалась по числу клеток, экспрессирующих GFP, и составила 70% для hMSC, тогда как при липофекции – 50%, при микроинъкции – 10%.
Таким образом, методика может применяться для точных манипуляций с клеткой в условиях близких к естественным, представляя, возможно, наиболее безопасный и эффективный способ генотерапии ex vivo.
Работа «High-efficiency DNA injection into a single human mesenchymal stem cell using a nanoneedle and atomic force microscopy»
http://dx.doi.org/10.1016/j.nano.2008.03.005 выполнена в рамках Industrial Technology Research Grant Program от New Energy and Industrial Technology Development Organization of Japan и опубликована в Nanomedicine.