от АВТОРА БЛОГА: ВОКРУГ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ОЧЕНЬ МНОГО РАЗГОВОРОВ,ТАК ЧТО ЖЕ ЭТО ТАКОЕ?..
Технология стволовых клеток в биотехнологии — это своеобразный ящик Пандоры, который скрывает многие тайны жизни, — но какова цена таких открытий? В научном аспекте применение этой технологии кажется безграничным, но этические соображения и нормы уже сейчас ставят барьеры на пути ее развития. Технология стволовых клеток может привести к новому пониманию развития и дифференциации клеток, как и почему развиваются определенные ткани, почему возникают заболевания и как их лечить. Станет возможным клонирование от отдельных тканей до целых организмов.Необходимо рассматривать предмет клеточных технологий — стволовые клетки — с научной, этической и юридической точек зрения. Выражение “неполное знание хуже полного невежества” как нельзя более уместна в биотехнологии, где особенно необходимо досконально разобраться в вопросе, прежде чем высказываться “за” или “против”.
Изучение стволовых клеток началось около 40 лет назад, в начале 1960-х, с получения стволовых клеток из костного мозга. Выделенные клетки были способны давать начало многим тканям, главным образом, клеткам крови. Двадцать лет назад в лабораторных условиях были выделены стволовые клетки мыши. Эту методику пытались использовать для получения человеческих стволовых клеток, но из-за проблем, связанных с их выделением и клонированием, это удалось только в 1998.
Есть два различных типа стволовых клеток. Первые — это эмбриональные стволовые клетки, из которых состоит эмбрион. Стволовые клетки другого типа называются взрослыми или соматическими, их происхождение в настоящий момент достоверно не известно. Можно только сделать предположение, что это остатки эмбриональных стволовых клеток, по какой-то причине оставшихся в тканях недифференцированными.
Продолжение исследований на эту тему стимулируется возможностями медицинского применения стволовых клеток для лечения больных или травмированных тканей как регенерирующего или репаративного средства и нашим интересом ко всему, что может ответить на вопросы о сущности жизни.
Что такое стволовые клетки?
Что же такое стволовые клетки, и какие именно качества делают их особыми? Стволовые клетки определяются тремя основными характеристиками. Во-первых, это неспециализированные клетки (в отличие от клеток, из которых состоят мышцы, мозг и т.д.). Во-вторых, стволовые клетки способны делиться в течение долгого времени, причем в результате каждого деления образуются две идентичные клетки. Третье важное свойство стволовых клеток — то, что они способны к дифференциации в специфические типы клеток, такие как клетки мышц, мозга, крови. Стволовые клетки можно найти в любой животной ткани, а, поскольку эмбрионы состоят из стволовых клеток, которые при делении и дифференциации превращаются в специализированные клетки и ткани, все мы в конечном счете состоим из стволовых клеток. Клетки однодневного эмбриона способны дифференцироваться в любой из около 220 типов клеток, образующих человеческое тело.
Во взрослых организмах небольшое число стволовых клеток присутствует во всех органах, выполняя функцию репарации поврежденных и больных тканей. Чем моложе организм, тем больше запас стволовых клеток, и, соответственно, восстановительный потенциал. Кроме восстановления утраченных функций органов и тканей, стволовые клетки способны тормозить неконтролируемые патологические процессы, такие как воспаления, аллергии, онкологические процессы, старение и т.д..
Предполагается, что использование в медицине стволовых клеток даст возможность успешно бороться с заболеваниями, сейчас считающиеся неизлечимыми.
Как получают эмбрионы для исследования стволовых клеток?
Один из основных источников получения стволовых клеток в настоящее время — эмбриональные ткани. Для получения стволовых клеток необходимо разрушение эмбрионов, источников получения которых четыре, и каждый имеет свои этические “но”. Наименее морально проблематичен метод получения эмбрионов методом экстракорпорального оплодотворения, но многие группы исследователей используют другие способы.
Четыре источника получения эмбрионов
* Клиники, практикующие экстракорпоральное оплодотворение, во время оплодотворения in vitro обычно используют более одной оплодотворенной яйцеклетки, так как часто первая имплантация может оказаться безуспешной, и требуется еще несколько процедур. В результате остаются тысячи невостребованных яйцеклеток, которые можно использовать для получения стволовых клеток.
* Абортивный материал
* Эмбрионы — продукты клонирования
* Эмбрионы, специально полученные для выделения стволовых клеток, путем смешивания яйцеклеток и спермы.
В чем различие между двумя типами стволовых клеток?
Кроме источника получения стволовых клеток между ними множество других различий. Наиболее важное — их способность выживать в лаборатории без дифференциации. Эмбриональные стволовые клетки способны реплицироваться, оставаясь недифференцированными в течение года, что для стволовых клеток из взрослых организмов недостижимо. Стволовые клетки из взрослых организмов присутствуют во всех тканях и активируются при заболевании или повреждении ткани, они более дифференцированы, чем эмбриональные.
Как происходит дифференциация стволовых клеток?
При получении “сигнала” извне стволовые клетки способны к дифференциации в различные типы клеток и тканей. Эти сигналы в любом организме возникают естественным путем, но могут быть созданы искусственно в лабораторных условиях. Эмбриональные стволовые клетки могут дифференцироваться в три различных типа тканей: эндодерму, дающую начало внутренним органам, мезодерму (соединительная ткань, мышцы, систему кровообращения и костная ткань) и эктодерму (кожа, органы чувств и нервные клетки). Из-за этой способности дифференцироваться в различные типы тканей эти клетки называют мультипотентными. Если взвесь эмбриональных стволовых клеток оставить в жидкой среде, они начнут собираться вместе, образуя эмбрионоподобную структуру и спонтанно дифференцироваться.
На рисунке продемонстрирована такая спонтанная дифференциация.
Соматические клетки также способны к дифференциации, однако более ограниченной, чем эмбриональные. Соматические клетки одного типа способны давать начало другим типам клеток. Эта способность называется пластичностью. Это свойство делает возможным применение соматических стволовых клеток для терапии и репарации больных и поврежденных тканей. Однако, использование соматических стволовых клеток ограничивает то, что они труднее поддаются дифференциации и культивируются в лабораторных условиях хуже, чем эмбриональные.
В случае болезни или ранения стволовые клетки могут быть использованы для восстановления или замещения поврежденной ткани. Исследователи ищут применение этой технологии для лечения особенно значимых для человечества заболеваний, таких как болезнь Паркинсона, диабет, повреждения спинного мозга, мышечные дистрофии, болезнь Альцгеймера, ожоги, артриты, потеря зрения и слуха и т.д.. Есть и другие причины изучать стволовые клетки. Первая — это способ получить новое знание о том, как организм развивается из одной клетки, какие сигналы “включают” механизмы дифференциации, и как это происходит. Это даст возможность врачам полнее понять и, возможно, предотвращать пороки развития плода. Вторая — то, что понимание механизма пролиферации стволовых клеток может дать новую информацию о причинах и развитии онкологических заболеваний для их предотвращения и/или эффективного лечения.
Перспективы клеточных технологий
Перспективы применения клеточных технологий во многих областях медицины, включая трансплантацию органов, испытание лекарственных препаратов, лечение и восстановление поврежденных тканей, очень заманчивы и близки, но до начала полного использования потенциала клеточных технологий необходимо разрешить следующие проблемы:
* Стволовые клетки должны быть доступны в достаточных количествах
* Дифференциация стволовых клеток должна быть строго направленной и специфичной
* Стволовые клетки должны быть жизнеспособны в организме реципиента
* После трансплантации стволовые клетки должны быть способны интегрироваться в ткани реципиента
* Трансплантант должен функционировать в течение всей жизни реципиента
* Трансплантация не должна наносить какого-либо вреда реципиенту (включая иммунную реакцию отторжения).
Пока неизвестно, универсальны ли соматические стволовым клетки в той же мере, что и эмбриональные, особенно при лечении болезни Паркинсона и диабета. Также замечено, что наращивать большие количества соматических стволовых клеток гораздо сложнее, чем эмбриональных, и есть опасение, что соматические клетки со временем утрачивают свой потенциал.
Терапия с применением стволовых клеток
Проведение терапии стволовыми клетками стало настоящей сенсацией в лечении многих тяжелейших заболеваний. Успехи современной терапии злокачественных заболеваний во многом связаны с этим быстро развивающимся направлением.
Стволовые клетки могут быть использованы для получения или тканей или целых органов, специально адаптированных под будущих реципиентов. Заместительная клеточная терапия при болезнях Альцгеймера и Паркинсона, также как при многих формах паралича и ранее неизлечимых аутоиммунных заболеваниях — это наиболее актуальные направления исследований. Трансплантация стволовых клеток крови является альтернативой трансплантации костного мозга и в ряде случаев имеет перед ней преимущества (например, аутотрансплантация при химиотерапии или радиационном поражении).
Антигены тканевой совместимости — HLA. Типирование антигенов
Серьезная проблема при использовании стволовых клеток для трансплантации — их иммунологическая совместимость с тканями реципиента. Решение проблемы может быть достигнуто клонированием 10-дневного эмбриона, содержащего ДНК реципиента, для выделения стволовых клеток (такое клонирование называют “терапевтическим”, несмотря на то, что в результате клонированный эмбрион погибает). В этом случае можно говорить об изотрансплантации (если донор и реципиент принадлежат к одному и тому же виду, говорят об аллотрансплантации; если к разным — о ксенотрансплантации). Вероятность отторжения ксено- и аллотрансплантатов, в отличие от изотрансплантатов, очень высока. Оно происходит, когда трансплантант отличается от реципиента антигенами тканевой совместимости (гистосовместимости — HLA — от англ. “human lymphocyte antigens”) — протеинами, находящимися на поверхности лейкоцитов и других тканей человеческого тела. Классифицикация (или типирование) у донора и реципиента набора специфических антигенов, называемых HLA-A, HLA-B и HLA-DR, дают информацию о совместимости их тканей.
Известно семь разных генов гистосовместимости, расположенных на одном участке ДНК и образующих так называемый “главный комплекс гистосовместимости” (MHC — “major histocompatibility complex”) 6-й хромосомы. Местоположение (локус) каждого из этих генов обозначают буквами (соответственно A, B, C и D; локус D несет 4 гена). Хотя в одном организме каждый ген может быть представлен только двумя разными аллелями, в популяции таких аллелей (следовательно, и HLA-антигенов) множество. Так, в локусе A выявлено 23 аллеля, в локусе B — 47, в локусе C — 8 и т.д. Антигены HLA, кодируемые генами локусов A, В и C, называют антигенами класса I, а кодируемые генами локуса D — антигенами класса II. Антигены класса I химически сходны, но существенно отличаются от антигенов класса II. Все HLA-антигены представлены на поверхности разных клеток в разных концентрациях. При трансплантации стволовых клеток (как и при любой другой трансплантации) проводят HLA-типирование донора и реципиента для выявления их гистосовместимости, что сводит к минимуму риск отторжения. Для этого используют серологический или молекулярный методы типирования.
При типировании тканей основное внимание уделяется идентификации антигенов, кодируемых локусами A, B и D.
Молекулярные методы типирования — генотипирование — донора
Для молекулярно-генетического типирования используются SSO (sequence specific oligonucleotides) и SSP (sequence specific primers) технологии. Технология SSO включает этапы ПЦР с последующей детекцией путем гибридизации ампликонов с олигонуклеотидными зондами.
Технология SSР базируется на ПЦР с использованием аллель-специфических праймеров с последующей детекцией методом гель-электрофореза.
Способы введения стволовых клеток
Введение стволовых клеток в организм реципиента производится в стерильных условиях профессионально подготовленным медицинским персоналом, как правило, амбулаторно. Принятые методы: внутривенное, внутримышечное, подкожное или в виде аппликаций.
Банки пуповинной крови
По ряду причин (по большей части очевидных) использование альтернативных костному мозгу источников гемопоэтических клеток для трансплантации очень актуально. Одним из многих источников гемопоэтических стволовых клеток для трансплантации является пуповинная кровь.
Использование пуповинной крови как источника стволовых клеток
Кровь из пуповины, несколько десятков миллилитров которой выливается при рождении ребенка, содержит немало стволовых клеток, в основном кроветворных “предшественников” — гемопоэтических прогениторных клеток — ГПК Общая концентрация ГПК в пуповинной крови ниже, но число ранних клеток-предшественников значительно выше, чем в костном мозге (например, в пуповинной крови содержится в 2 раза больше полипотентных ГПК, чем в таком же объеме трансплантата костного мозга). Но главное, пуповинную кровь не надо специально забирать с помощью особого оборудования. Достаточно вовремя собрать ее после родов в стерильный пластиковый контейнер, затем провести анализ ее образца, заморозить с помощью жидкого азота и поместить на хранение. За 1 раз может быть забрано в среднем около 80 — 100 мл пуповинной крови. В среднем, для трансплантации достаточно 1 мл пуповинной крови на 1 кг массы тела реципиента.
Использование пуповинной крови имеет ряд преимуществ перед использованием костного мозга:
1. Пуповинная кровь не имеет других применений и в большинстве случаев выбрасывается вместе с плацентой и пуповиной.
2. Использование пуповинной крови не причиняет донору никакого вреда, и эту кровь легко собирать.
3. Криообработанную пуповинную кровь можно использовать сразу после HLA-типирования.
4. Вероятность заражения вирусными инфекциями низка и может быть заранее исключена.
5. Возможность выполнения иммунологических перекрестных проб с реципиентом дает преимущество использованию криообработанной пуповинной крови перед трансплантацией костного мозга.
6. Сбор пуповинной крови от детей, принадлежащих к этническим меньшинствам, позволяет компенсировать относительный недостаток трансплантатов в этой группе и повысить вероятность получения HLA-совместимого трансплантата для представителей этнических меньшинств.
В перспективе такой банк сможет заменить банк доноров костного мозга, причем время поиска подходящего донора и стоимость операции сократятся в несколько раз.
Согласно “ПРИКАЗУ Министерства здравоохранения от 25 июля 2003 г. N 325 (Приложение N 2) при поступлении в Банк СК образца пуповинной/плацентарной крови проводятся:
1. Определение количества CD34+ клеток
2. Определение количества ядросодержащих клеток
3. Типирование по антигенам гистосовместимости 1 и 2 класса: HLA-A, В и DR.
4. Определение группы крови по системе АВО и резус-фактора.
5. Тестирование на инфекционные агенты:
* Anti-HIV-1 и -2, HIV1-Ag
* Anti-HTLV-I и -II
* Anti-HBcor-Ag, HBs-Ag
* Anti-HCV
* Anti-CMV
* Anti-Toxoplasma gondii
* RW
* Staphilococci
* Streptococci
* Enterococci
* Neisseria gonorrheae
* Candida species
* Aspergillus species
* Esherihia coli.
Создание банков пуповинной крови в России
В настоящее время в России действует компания CRYOMEDICA (КРИОМЕДИКА) — первый российский банк стволовых клеток, однако, в соответствии с ПРИКАЗОМ Минздрава РФ от 25.07.2003 N 325 “О РАЗВИТИИ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ” и Решением Комитета здравоохранения г. Москвы в России в ближайшем будущем возникнут еще как минимум два государственных банка пуповинной крови: один — федеральный, другой — созданный по инициативе московского правительства и финансируемый из бюджета города. Банки будут общественными, донорскими. Пуповинную кровь туда будут доставлять из родильных домов. Не исключено, что “родная” пуповинная кровь когда-нибудь может пригодиться для лечения самого донора, однако, банки будут открыты для пользования, и из них смогут брать донорский материал многие гематологические учреждения. В банках будет находиться вся необходимая информация о последующей судьбе ребенка и о его родителях, об их болезнях — для выявления скрытых инфекций, редких генетических заболеваний, которые дают о себе знать не сразу.
Организацией банков пуповинной крови в России начинают заниматься частные компании, готовые вкладывать в это немалые суммы, но, в этом случае, речь скорее идет о платном хранении крови в интересах самого донора, т.е. цели у частных и государственных банков пуповинной крови разные, однако, и те и другие должны будут придерживаться стандартов GMP.
Основные задачи банков пуповинной крови
1. организация заготовки и транспортировки пуповинной/плацентарной крови для научных исследований;
2. тестирование и типирование заготовленной пуповинной/плацентарной крови;
3. выделение концентрата стволовых клеток пуповинной/плацентарной крови человека;
4. криогенное хранение образцов стволовых клеток пуповинной/плацентарной крови человека в жидком азоте;
5. предоставление образцов стволовых клеток пуповинной/плацентарной крови человека научным и образовательным медицинским организациям для выполнения научных исследований;
6. предоставление образца стволовых клеток пуповинной/плацентарной крови человека физическому лицу в соответствии с условиями договора, заключенного с ним.
Ссылка на материал http://www.ld.ru/catalog/rts/pcr/stem-ct.html