Общая характеристика заболевания , гена и продуктов его экспрессии
в норме и при МДД
Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) является наиболее распространенным
наследственным нервно-мышечным заболеванием человека. Его частота составляет
около 1:5000 новорожденных мальчиков.
Причиной МДД являются мутации в гене дистрофина (структурного белка)
cарколеммы, которые приводят к его отсутствию в мышечных клетках, следствием
чего является нарушение целостности мембраны и запуск процессов дегенерации
мышечного волокна.
Ген дистрофина является самым большим из известных генов человека и
составляет почти 0.1% (2,4 мпн.) всей геномной ДНК. Он локализован на коротком
плече Х хромосомы в районе Хр21.2, содержит 85 экзонов, и кодирует мРНК
размером около 14 тпн.
Основной продукт гена — мышечный белок дистрофин — имеет молекулярный
вес 427 кДа. Функция дистрофина заключается в
стабилизации сарколеммы мышечного волокна путем связывания
своим N-концом с актином — главным компонентом
внутриклеточной системы
микрофиламентов, а С- концом — с группой дистрофин ассоциированных дистро-
и саркогликанов — белков сарколеммы и через них с основным белком
внеклеточного матрикса ламинином. Мутации в гене дистрофина приводят либо
к полному (миодистрофия Дюшенна) либо к частичному (миодистрофия Беккера)
отсутствию одноименного белка, следствием чего является нарушение нормального
функционирование мембраны мышечной клетки.
Повышенная проницаемость мембран или наличие в них физических разрывов,
характерных для пренекротических или некротических волокон, приводит к
оттоку ферментов из мышц в сыворотку крови. На начальной стадиях заболевания
дегенерация мышечных волокон компенсируется активной регенерацией
фибрилл, благодаря делению и слиянию миогенных сателлитных клеток.
Однако, с возрастом этот процесс становится всё менее эффективным, вызывая
прогрессирующую мышечную слабость и смерть в результате нарушения
функций сердца и диафрагмы [17].
Биологические модели МДД
Большинство исследований по разработке подходов
к генотерапии МДД проводятся на мышах со спонтанными или
индуцированными мутациями в гене дистрофина. Первой биологической моделью
заболевания была спонтанная мутация mdx мышей линии C57BL/10J. В настоящее
время создан ряд линий мышей с мутациями в гене дистрофина. Наиболее близкими
к человеку по тяжести и патогенезу заболевания являются мыши mdx52
с делецией 52 экзона, а также недавно полученные мыши mdx с направленной
мутацией (knock-out) в гене утрофина — аутосомного аналога дистрофинового
гена.
По тяжести нарушений и клиническому проявлению наиболее близкой к человеку
моделью МДД является заболевание, индуцированное мутациями в гене дистрофина
у собак породы золотой ретривер. Именно на них рекомендуется проводить
завершающий этап предклинического тестирования ГТ МДД.
Клеточная терапия МДД
Эффективная медикаментозная терапия МДД до настоящего времени
отсутствует. В начале 90-х годов Питером Лоу.( Peter Law, Ph.D., Cell Therapy
Research Foundation, Memphis, USA) было предложено лечение МДД путем трансплантации
аллогенных миобластов. Суть метода заключалась в заборе материала
у здорового донора, выращивании миобластов в условиях клеточных культур
с последующей их трансплантацией в мышцы больного. Стоимость операции оценивалась
около 150 тыс. долларов. Исследования по проверке эффективности трансплантации
аллогенных миобластов были проведены в 6 независимых исследовательских
лабораториях. Результаты были доложены на Рабочем Совещании в Париже
в апреле 1999г [18]. Согласно мнению ведущих авторитетов в области биологии
мышц и миодистрофии Дюшенна Терри Партриджа (Великобритания) и Луиса
Кункеля (США) в существующем на данный момент виде метод трансплантации
миобластов (т.е. клеточной терапии по методу Питера Лоу) абсолютно
неэффективен [19,20]. В их экспериментах на мышах с использованием
разнообразных клеточных маркеров и современных методов FISH анализа
было показано что уже через 24 часа после трансплантации 90% гетерологичных
миобластов отмирает или исчезает из места трансплантации, 5% находятся
в покоящемся состоянии, 5% сливаются с пораженными мышечными волокнами,
но только в половине из них (2.5%) наблюдается синтез дистрофина.
Значительно более перспективным направлением клеточной терапии
МДД представляется трансплантация аутологичных стволовых клеток, полученных
из костного мозга или скелетных мышц. В исследованиях
Луиса Кункеля, Ричарда Муллигана и Эмануэллы Гуссони высокоочищенные стволовые
клетки костного мозга здорового донора трансплантировали
облученным mdx мышам. Было показано, что в результате
трансплантации регенерируют не только клетки костного мозга реципиента,
но значительная часть инъецированных клеток мигрирует и в скелетные мышцы,
где сливаясь с миофибриллами восстанавливает синтез дистрофина. По прошествии
12 недель после трансплантации доля дистрофин положительных
волокон увеличивалась с 1 до 10%. Таким образом, доказано, что в костном
мозге присутствуют стволовые клетки не только всех форменных элементов
крови, но и предшественники миобластов. В виду широкого распространения
мультипатентных стволовых клеток после трансплантации, открывается возможность
не только локального но и системного исправления дефекта в
различных группах мышц при МДД [21].
Генная терапия МДД
Несмотря на очевидные успехи в исследованиях структуры гена дистрофина,
его продуктов, и в выяснении биомеханизмов заболевания, реальных успехов
в генотерапии МДД пока не достигнуто. Причиной этого являются, по-видимому,
не только гигантские размеры гена и его мРНК, но и, главным образом, отсутствие
эффективных средств доставки гена в мышцы.
Считается, что достижение терапевтического эффекта возможно при успешной
трансфекции не менее 20%, а по последним данным даже 40% всех мышечных
волокон не только скелетной мускулатуры, но так же мышц сердца и диафрагмы.
При этом основными критериями эффективности трансфекции являются: появление
дистрофин-положительных мышечных волокон (ДПМВ), нормализация уровня биохимических
маркеров МДД, изменения физиологических параметров (силы мышц и др.).
В активно разрабатываемых в настоящее время генотерапевтических подходах
к лечению МДД можно выделить несколько направлений:
- коррекция дефекта путем введения нормальных копий кДНК гена дистрофина
в составе рекомбинантных вирусных частиц или посредством невирусных способов
доставки; - коррекция мутаций на уровне геномной копии гена
или на его первичном РНК- транскрипте; - активация в мышечных волокнах и клетках репрессированного в ходе онтогенеза
аутосомного гомолога гена дистрофина — гена утрофина
Трансфекция мышечных волокон с использованием
вирусных векторов
Эксперименты проводились как с ретровирусными векторами, несущими укороченную
(6,4 тпо) к ДНК «мини» гена дистрофина, так и с аденовирусными векторами,
способными нести полноразмерную (14тпо) кДНК этого гена. Результаты этих
опытов подробно рассмотрены в ряде обстоятельных обзоров [22, 23].
В экспериментах на мышах удалось продемонстрировать достаточно
эффективную и долговременную трансфекцию скелетных и сердечной мышц после
внутривенного введения рекомбинантного аденовируса с кДНК гена дистрофина.
Была так же продемонстрирована принципиальная возможность
трансфекции и синтеза дистрофина в мышцах диафрагмы mdx мышей с использованием
полноразмерной кДНК гена дистрофина человека. Кроме нормализации
синтеза дистрофина , удалось показать, что сверхэкспрессия этого
гена (уровень белка в 50 раз выше нормы) не оказывает вредных побочных
эффектов.
Вместе с тем, использование вирусных носителей, особенно в экспериментах
in vivo, наталкивается на существенные методические трудности. К ним
относятся — недостаточная пакующая способность у ретровирусов, необходимость
наличия клеток-хелперов. Наибольшим серьезным препятствием к использованию
вирусных векторов для доставки генетических конструкций
является выраженный иммунный ответ на вирусные антигены. Несмотря на огромный
объем работ по модификации генома вируса носителя, сокращения размера вирусного
генома до минимально возможного размера, иммунный ответ тем не менее
сохраняется и делает бессмысленными повторные введения генных конструкций.
Тем не менее работы по совершенствованию вирусных способов доставки
не прекращаются. Как сообщалось на IV Рабочем совещание по генной терапии
МДД в Париже [1999] в результате трансфекции мышц mdx мышей рекомбинантным
аденовирусным вектором, лишенным большинства своих генов (gutted adenovirus
vector) и несущим кДНК гена дистрофина, эффективность трансфекции достигала
10-20% ДПМВ, а в отдельных экспериментах превышала 25 %. При этом регистрировалось
усиление сократительной силы мышц. Наиболее перспективно введение гена
дистрофина новорожденным мышам. Было продемонстрировано, что в результате
трансфекции мышат аденовирусным вектором и компактизацией ДНК полилизином
pK8, экспрессия дистрофина регистрировалась в течении почти 1 года.
Используя аденовирусный вектор с полноразмерной кДНК гена дистрофина
уже год назад предполагалось провести первое клиническое испытание по ГТ
МДД в Университете штата Огайо, Коламбус (США). О начале первой программы
по клиническому испытанию генно-инженерной конструкции дистрофина с аденовирусным
носителем сообщила на Рабочем Совещании в Париже 1999 г. группа французских
ученых во главе с С.Брауном (Sergio Brown, Genotone, Strasburg, France).
Однако, до сих пор ни американская, ни французская программа по фазе I
клинических испытаний ГТ МДД еще не начались. Вместе с тем, нельзя не отметить,
что именно в Коламбусе , в Университете Штата Огайо 2 сентября 1999 года
Донован Декер — больной с конечностно-плечевой формой мышечной дистрофии,
вызванной мутацией в гене мышечного белка саркогликана — стал первым пациентом
в мире с мышечной дистрофией, который получил инъекцию генно-иженерной
конструкции на базе адено-ассоциированного вируса и кДНК гена саркогликана.
Невирусные способы доставки кДНК гена дистрофина
Невирусные способы доставки включают баллистическую трансфекцию,
методы электропорации (электрошока), введение генетических конструкций
в составе липосом или упакованных с помощью олигопептидов, молекулярных
коньюгатов, полимерных носителей.[1, 6-8, 23]. Эти носители в значительной
мере лишены недостатков присущих вирусным векторам, однако, способность
к трансформации у большинства из них ниже, чем у вирусных векторов. Первые
эксперименты по доставке «голой» плазмидной ДНК с кДНК гена дистрофина
человека показали возможность трансфекции и появление
ДПМВ у mdx мышей.
Наиболее продвинутыми на сегоднешний день являются исследования по доставка
гена дистрофина методом электропорации или с носителем на основе
полимерной формы декстрана [18]. В последнем случае для доставки гена дистрофина
использовали декстран, обеспечивающий самособирающийся ДНК полимерный комплекс.
Отсутствие токсичности и иммунного ответа, дессиминация по различным
группам мышц и достаточно длительная (более двух месяцев) экспрессия
показали перспективность данной системы доставки
для проведения клинических испытаний.
Еще более обнадеживающие результаты получены в экспериментах на мышах,
крысах, кроликах и обезъянах по доставке генетических конструкций
в мышцы с помощью электропорации. Восьмикратный электрический
импульс (200 V/cm2, 20 мсек, 17 Гц), через 30 секунд после
введения плазмид с геном LacZ приводил к синтезу b-галактозидазы в 76%
мышечных волокон, а с использованием электрошока только в 8%
[24].
Генная терапия на уровне первичного транскрипта гена
дистрофина
Некоторые подходы, используемые в настоящее время для коррекции мутаций
в самом гене или в его первичном РНК-продукте уже рассмотрены нами выше.
Особое внимание привлекает техника направленной утраты экзона, несущего
мутантный стоп-кодон, разработанная в лабораторе Дж. Диксона (George Dickson)
в Великобритании. Работа выполнялась in vitro на миобластах мышей
mdx с нонсенс мутацией в 23 экзоне гена дистрофина. В
условиях in vitro было показано что уже через 6
часов после трансфекции специфическими олигонуклеотидами
удаление мутантного 23 экзона происходило в 50% мРНК и в 100% мРНК через
24 часа [25]. Перспективность данного подхода заключается
в том, что миобласты начинают синтезировать полноразмерный белок дистрофина,
хотя и дефектный по одному функционально несущественному экзону. Будучи
пересаженными больному модифицированные миобласты смогут восстанавливать
функцию и предотвращать гибель пораженных мышечных волокон.
Активизация экспрессии утрофина — аутосомного гомолога гена дистрофина
Оригинальный подход к генотерапевтическому лечению МДД разрабатывается
в Оксфордском университете группой под руководством Кей Девис (Kay
Davies). Суть метода заключается в попытке дерепрессии аутосомного гомолога
дистрофина – гена утрофина, продукт экспрессии которого
мог бы быть способен компенсировать недостаток дистрофина во всех группах
мышц. В эмбриогенезе человека приблизительно до семи недель развития
дистрофин не экспрессируется и его функцию в мышцах выполняет белок утрофин.
В промежутке между седьмой и 19 неделями развития экспрессируются
оба белка и после 19 недели происходит замещение мышечного утрофина на
дистрофин. После 19 недели эмбрионального развития утрофин обнаруживается
только в области нервно-мышечных контактов.
Белок утрофин, имея аутосомную локализацию разительно напоминает
дистрофин своими N- и С- концевыми доменами, играющими решающую роль в
функции дистрофина, тогда как функционально малозначимый центральный rod
domain присутствует в утрофине в сильно укороченном варианте. Уже получены
данные свидетельствующие о том, что трансфекция mdx мышей in vivo
геном утрофина приводит к экспрессии утрофина в скелетной мускулатуре
и диафрагме [26]. Результаты экспериментов указывают на принципиальную
возможность коррекции дефектов в мышечных волокнах лишенных дистрофина
с помощью утрофина. Основное внимание последних лет в этом направлении
сосредоточено на анализе промоторной области гена утрофина, а также
механизмов его регуляции. По последним данным, группе Кей Девис удалось
идентифицирован промотор В гена утрофина, воздействуя
на который можно включать и изменять уровень
экспрессии этого гена [18].
Собственные результаты
Исследования по генной терапии МД в России начаты 4 года назад в Институте
акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН (Санкт-Петербург)
и ведутся в комплексе с другими научно-исследовательскими институтами
России, (Институт молекулярной биологии им.акад. В.А. Энгельгардта РАН;
Институт цитологии РАН С-П, Научный Центр Медицинской Генетики РАМН, Институт
экспериментальной медицины РАМН С-П), в тесном контакте с ведущими лабораториями
по данной проблеме в Великобритании и Италии и частично финансируются
из грантов ГКНТ («Геном человека)», «Национальные приоритеты
в медицине» и РФФИ. В работе по исследованию невирусных способов
доставки генов в пораженные мышцы использованы экспрессионные плазмидные
конструкции как с полноразмерной кДНК гена дистрофина либо с кДНК
мини-гена дистрофина под различными промоторами (SV-40, MLV, HSA и др).
Апробированы следующие варианты невирусной доставки — баллистическая трансфекция
с использованием «генного» ружья [27], введение плазмидной ДНК, упакованной
в липосомы (липофектамин и полилизин) [28], аналоги вирусных олигопептидов
(K8 и JTS1) [29], синтетические полимерные микросферы [30], комплексы с
молекулярными конъюгатами лактоферрина [31]. Экспрессию трансгена
изучали с помощью молекулярных (ПЦР, RT-PCR, блотгибридизация, Northern-blot),
биохимических (иммуноблот, анализ мышечной креатинкиназы), гистологических,
иммуноцитохимических и молекулярно-цитогенетических (FISH)
методов.
Анализ результатов комплексных исследований эффективности трансфекции
мышечных волокон в условиях различных способов невирусной доставки
гена дистрофина в опытах in vivo на мышах mdx позволяет сделать
следующие основные выводы:
1. Эффект трансфекции (появление дистрофин-положительных мышечных
волокон – ДПМВ) наблюдается как при введении чистой плазмиды, так и при
доставке кДНК гена дистрофина с помощью различных невирусных
носителей; число ДПМВ при использовании носителей и продолжительность
экспрессии трансгена достоверно больше, чем в опытах с «голой»
плазмидой.
2. В оптимальных вариантах (использование «генного ружья», в/м
введения «минигена» дистрофина в составе микросфер) достигнута успешная
трансформация (т. е. коррекция генетического дефекта) в 15-20%
мышечных волокнах мышей mdx. Экспрессия трансгена достигала максимального
уровня через 3 недели и регистрировалась вплоть до 6-и месяцев после
однократного введения.
3. Перспективными для генотерапии МДД являются также вирусные
олигопептиды и лактоферриновые конъюгаты, но не липосомы.
4. Выявленный в этих экспериментах феномен «дистантной трансфекции»
(появление ДПМВ в контралатеральной мышце при в/м и в разных скелетных
мышцах после в/в введения) открывает реальные перспективы для системного
лечения МДД путем парэнтерального введения экспрессирующихся генно-инженерных
конструкций в составе невирусных носителей.
5. Применение метода FISH позволяет проследить за судьбой введенных
генноинженерных конструкций in vivo и доказать их активную инкорпорацию
в ядра миофибрилл при использовании синтетических микросфер и их кластерное
расположение вблизи ядерной мембраны мышечных волокон при использовании
лактоферрина и вирусных олигопептидов.
6. Экспрессирующие генные конструкции, нагруженные в синтетические полимерные
микросферы способны преодолевать гемато-энцефалический и плацентарный
барьеры, что делает данный носитель весьма перспективным для генной
терапии плода или доставки терапевтических генов в мозг.
7. Испытанные невирусные носители (за исключением «генного ружья») не
вызывают дегенеративных изменений в мышцах и не индуцируют
иммунного ответа.
Таким образом, в результате проведенных комплексных исследований с использованием
плазмидных конструкций с геном дистрофина и рядом маркерных генов (b-галактозидазы
— LacZ, люциферазы — Luc) апробированы новые векторы и способы доставки
в опытах in vivo, выявлены достаточно перспективные невирусные носители
кДНК гена дистрофина, намечены наиболее перспективные пути повышения эффективности
трансфекции мышечных фибрилл и кардиомиоцитов, т.е. заложена реальная экспериментальная
база для продолжения разработки новых подходов ГТ МДД в России,
а в перспективе и для фазы I клинических испытаний этого смертельного
наследственного заболевания.