Исследовательская команда из Массачусетской больницы общего профиля (Massachusetts General Hospital, MGH, США) разработала способ, позволивший расширить область применения и повысить точность мощного инструмента генного редактирования, называемого CRISPR/Cas9. В журнале Nature ученые описывают новые варианты разрезающего ДНК фермента Cas9, полученные путем направленной эволюции. Эти варианты способны распознавать большее число разных последовательностей нуклеиновых кислот, по сравнению с природными вариантами фермента Cas9, которые обычно используют специалисты.
«Мы продемонстрировали, что на сайты генов человека и рыбок данио, которые ранее невозможно было изменить с помощью дикого варианта фермента Cas9, теперь можно таргетно воздействовать с помощью созданных нами новых вариантов этого фермента. Это позволит исследователям направленно влиять на более широкий спектр сайтов в различных геномах, что очень пригодится в исследованиях, требующих высокой точности при определении последовательностей ДНК», – говорит Бенджамин Кляйнстивер (Benjamin Kleinstiver), научный сотрудник отделения молекулярной патологии при MGH (MGH Molecular Pathology Unit, США), ведущий автор исследования.
Нуклеазы CRISPR-Cas9 состоят из бактериального фермента Cas9 и короткой молекулы РНК, образованной 20 нуклеотидами и соответствующей таргетной последовательности ДНК. Кроме совпадения РНК/ДНК фермент Cas9 должен распознать специфическую нуклеотидную последовательность, называемую PAM (protospacer adjacent motif) на таргетной ДНК. Самый часто используемый вариант фермента Cas9, полученный из бактерий Streptococcus pyogenes и получивший название SpCas9, распознает последовательности PAM, в которых за любым из четырех нуклеотидов следует две молекулы гуанина, одного из оснований, образующего ДНК. Это ограничивает варианты последовательностей ДНК, на которые может таргетно воздействовать фермент SpCas9, до молекул ДНК, в которых последовательно находятся две молекулы гуанина.
Чтобы обойти это ограничение, исследовательская команда из MGH разработала способ, позволивший им быстро развить способность фермента SpCas9 распознавать новые последовательности PAM. Изучив коллекцию случайно мутировавших вариантов фермента SpCas9, ученые определили комбинации мутаций, которые позволили ферменту SpCas9 распознавать новые последовательности PAM. Варианты фермента, полученные путем направленной эволюции белков, в два раза увеличили диапазон сайтов, на которые можно направленно воздействовать при генном редактировании с использованием фермента SpCas9. Ученые также выявили вариант фермента SpCas9, который с меньшей степенью вероятности вызывает генные мутации, иногда вносимые системой CRISPR-Cas9. Эта проблема была впервые описана в 2013 г. в исследовании, проведенным под руководством доктора Дж. Кита Чжуна (J. Keith Joung), руководителя исследований отделения патологии в MGH (MGH Department of Pathology, США), одного из авторов нового исследования. «Новые варианты фермента с повышенной специфичностью должны быть полезны всем исследователям, которые сейчас используют дикий тип фермента SpCas9 и должны уменьшить частоту нежелательных мутаций», – говорит Чжун, профессор патологии Гарвардской Медицинской Школы (Harvard Medical School, США).
«Полученные нами результаты приводят первые доказательства того, что работу фермента SpCas9 можно изменить путем направленной эволюции белков. Мы считаем, что и другие полезные свойства фермента можно модифицировать с помощью аналогичного подхода, позволяющего адаптировать к специфическим потребностям его многие важные функции», – комментирует Чжун.
Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология»