Теперь мощный метод редактирования генома стал еще более точным. Исследователи усовершенствовали фермент Cas9, важнейший компонент системы CRISPR-Cas9, что позволило сократить число ошибок этого метода вплоть до неопределимых значений. Результаты исследования были опубликованы в начале января в журнале Nature [1].
Исследователи используют систему CRISPR-Cas9 для внесения изменений в геном за счет удаления или редактирования дефектного (мутантного) гена. Эксперименты показали, что применение этого метода эффективно почти у каждого организма, включая человеческие эмбрионы.
Метод редактирования генома CRISPR-Cas9 основан на использовании фермента Cas9, который, в свою очередь, использует особую молекулу РНК-гид, которая направляет фермент к месту необходимого расщепления молекулы ДНК. Фермент Cas9 разрезает ДНК в нужном месте, что приводит к удалению короткого фрагмента ДНК и соединению концевых фрагментов с образованием новой последовательности.
Но данная технология не является идеальной: иногда фермент Cas9 создает нежелательные мутации. По мере того как метод CRISPR движется из лаборатории в клинику (с дебатами, посвященными вопросам использования метода на эмбрионах), исследователи совершили настоящий прорыв, позволяющий уменьшить частоту появления ошибок, возникающих при применении метода.
По словам Кита Жунга (Keith Joung), одного из авторов нового исследования, патолога из Главной Больницы Массачусетса в Бостоне (Massachusetts General Hospital, США), полученные результаты приближают ученых к их главной цели. «Это – значительный шаг вперед. Мы можем сильно снизить вероятность нецелевого действия системы», – комментирует он.
По мнению некоторых исследователей, для системы CRISPR частота появления ошибок не должна быть равной нулю, чтобы метод был клинически полезным. «В какой-то момент каждый должен решить, когда специфичное является достаточно специфичным. Идея о разработке инструмента, который всегда действует только специфично, является утопией», – говорит Чарльз Герсбах (Charles Gersbach), биоинженер из Университета Дьюка в Дареме (Duke University, США).
Безопасность на первом месте
Результаты предыдущего исследования показали, что применение более короткого РНК-гида, направляющего фермент Cas9, может уменьшить вероятность возникновения некоторых ошибок [2]. В декабре прошлого года специалист в области синтетический биологии Фенг Жанг (Feng Zhang) из Института Брода при Массачусетском Технологическом Институте (Broad Institute of MIT, США) и Гарвардского Университета в Кембридже (Harvard University, США) и его коллеги объявили о разработке фермента Cas9, который снижает частоту ошибок, ассоциированных с его нецелевым действием [3].
При проведении последнего исследования Жунг и его коллеги попытались усовершенствовать другую область фермента Cas9, изменяя фрагмент белка, контактирующий с ДНК-мишенью. Исследовательская команда также использовала более чувствительный метод обнаружения ошибок.
Ученые протестировали новый высокоточный фермент SpCas9-HF1 с восемью различными РНК-гидами. Созданный фермент разрезает таргетную ДНК почти так же эффективно, как и его неизмененный вариант. Он совершил только одну ошибку с одной из РНК-гидов. Неизмененный фермент Cas9 совершил ошибки при работе с семью из восьми РНК-гидов.
Ошибки фермента Cas9 были в центре внимания при многих дискуссиях, посвященных редактированию генома, включая дебаты, посвященные использованию метода на человеческих эмбрионах. Однако, по мнению Джорджа Черча (George Church), генетика из Института Уайса в Бостоне (Wyss Institute, США), теперь ученые могут сфокусировать свое внимание на других проблемах, поскольку точное конструирование молекулы РНК-гида позволяет избежать большинства нецелевых ошибок.
По словам Герсбаха, хотя это исследование является очень важным, учитывая скорость, с которой система CRISPR-Cas9 движется в направлении к клиническому применению, необходимо дополнительно оценить ее безопасность, прежде чем она станет считаться безопасной для использования на человеке.
Стремление к совершенству
В декабре прошлого года Герсбах и его коллеги объявили, что они использовали систему CRISPR-Cas9 для редактирования генетических мутаций, которые вызывают миодистрофию Дюшенна, на модели заболевания на мышах [4]. Для доставки фермента Cas9 в мышечные клетки ученые использовали вирус, который может экспрессировать фермент гораздо дольше, чем это было в опытах Жунга, что оставляет больше возможностей для нецелевого действия системы.
Однако, Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (US Food and Drug Administration, FDA) еще не утвердило проведение клинических испытаний системы CRISPR-Cas9. В то же время компания Sangamo BioSciences (Ричмонд, США) уже проводит клинические испытания на более чем 80 пациентах с использованием другого инструмента геномного редактирования – нуклеазы «цинковые пальцы» – с целью лечения гемофилии типа В и ВИЧ.
По словам Федора Урнова (Fyodor Urnov), научного сотрудника компании Sangamo BioSciences, чтобы разрешить проведение этого клинического испытания, регулирующие органы, помимо информации о нецелевом редактировании, хотели получить данные о безопасности, точнее, о том, насколько хорошо функционируют модифицированные клетки. Например, компания должна была продемонстрировать, что измененные Т-клетки иммунной системы ведут себя, как нормальные Т-клетки, или что отредактированные клетки печени продолжали работать, не проявляя признаков токсичности.
По мнению Урнова, это исследование представляет собой хороший задел для фермента Cas9. «Но, когда думаешь о применении метода геномного редактирования в клинике, ощущаешь, какая долгая дорога предстоит впереди», – комментирует Урнов.
По материалам NatureNews
Оригинальная статья: Nature doi:10.1038/nature.2016.19114
Литература:
1. Kleinstiver, B. P. et al. Nature http://dx.doi.org/10.1038/nature16526 (2015).
2. Yu, F. et al. Nature Biotechnol. 32, 279–284 (2014).
3. Slaymaker, I. M. et al. Science http://dx.doi.org/10.1126/science.aad5227 (2015).
4. Nelson, C. E. et al. Science http://dx.doi.org/10.1126/science.aad5143 (2015).
Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология»