Вначале коротко напомню суть методики пропуска экзонов
1. Гены — единицы наследственной информации. В них зашифрованы «инструкции», на основе которых синтезируются необходимые организму белки. Образно говоря, ген — это текст, состоящий из предложений (экзонов), которые в свою очередь состоят из слов (кодонов), которые состоят из букв (нуклеотидов). Кодоны всегда состоят из трех нуклеотидов. Так же тройками информация и считывается в процессе синтеза белка.
2. Миодистрофия Дюшенна (МДД), так же как и Беккера (МДБ), обусловлены мутациями (ошибками) в гене, кодирующем белок дистрофин. Основной тип мутаций — т.н. протяженные делеции, т.е. выпадение больших участков гена. Однако МДБ — более мягкая форма, с более поздним началом и большей продолжительностью.
3. Ген — это участок двухцепочечной ДНК. Кроме экзонов, в ДНК также присутствуют еще и некодирующие участки, называемые интронами, причем они перемежаются с экзонами. Синтез белков проходит в 3 этапа:
— на основе двухцепочечной ДНК формируется одноцепочечная РНК (это называется транскрипцией)
— из этой РНК «вырезаются» интроны, а оставшиеся экзоны «склеиваются» в непрерывную, уже чисто кодирующую последовательность — информационную РНК (этот процесс носит название сплайсинга)
— эта оставшаяся последовательность считывается специальной клеточной «машиной» — рибосомой (это называется трансляцией), в результате синтезируется белок
Этот процесс можно представить, опять же используя аналогию со словами и предложениями
THEMWTOMANATIANDPIQHISURDIDOGITRANOVINFORTRIATHEDOOPIBUS
Выделенные буквы — это интроны. Как видно — предложение бессмысленно, поэтому интроны надо удалить. После их удаления получается следующее
THEMANANDHISDOGRANFORTHEBUS
Разбив эту последовательность на тройки символов, получим предложение
THE MAN AND HIS DOG RAN FOR THE BUS
4. МДД и МДБ обусловлены аналогичными мутациями, однако последствия этих мутаций — разные
Если в вышеприведенном предложении «выпадет» только две буквы, например выделенные
THE MAN AND HIS DOG RAN FOR THE BUS
информация все равно будет считываться тройками символов, но последовательность будет уже совсем другая:
THE MAN AHI SDO GRA NFO RTH EBU S
Как видно — предложение стало бессмысленным. Это — пример мутации при МДД, белок становится либо нефункциональным, либо не синтезируется вовсе
Если же выпадет несколько целых «слов», например так
THE MAN AND HIS DOG RAN FOR THE BUS
результат будет таким
THE MAN RAN FOR THE BUS
Предложение стало короче, но имеет смысл. Это — мутация при МДБ: белок более короткий, но все же частично функционален
5. Суть методики «пропуска экзонов» — удалить из бессмысленного в результате ошибки предложения часть символов так, чтобы предложение вновь обрело смысл, трансформируя таким образом мутацию МДД в мутацию МДБ
Удалив выделенные символы
THE MAN AHI SDO GRA NFO RTH EBU S
получим
THE MAN RAN FOR THE BUS
т.е опять же частично функциональный белок.
Ниже – наиболее часто задаваемых вопросы по пропуску экзонов и подготовленные на них специалистами компании Prosensa и LUMC ответы
У моего сына мутация «…….», какой экзон должен быть пропущен?
Увидеть, сможет ли мутация вашего сына (или ваша) потенциально быть исправлена с помощью пропуска экзонов, вы можете с помощью этой схемы:
подобно элементам паззла (например, экзон 1 с экзоном 2, экзон 2 с экзоном 3 и т.д.)
Вы можете определить, какой экзон необходимо пропустить для корректировки определенной мутации, за 3 шага
Примеры различных мутаций представлены ниже
Шаг 1: Найти и обозначить нужную мутацию на схеме
Шаг 2: Посмотреть, совмещаются ли экзоны
Шаг 3: Оценить, какие соседние с мутацией экзоны должны быть пропущены, чтобы оставшиеся экзоны снова были совмещены
Пример 1: делеция экзонов 48-50
Шаг1 (выделена удаленная в результате мутации область)
Шаг 2 Последствия мутации
В результате делеции экзон 47 теперь присоединен к экзону 51. Они не совмещаются
Шаг 3 Какой экзон необходимо удалить?
Экзон 47?
Они также не совмещаются. Таким образом, пропуск экзона 47
не является решением в случае с этой мутацией
Экзон 51?
Таким образом, для этой мутации решением будет пропуск экзона 51
Пример 2: делеция экзона 45
Шаг 1 Обозначаем делецию
Шаг 2 Последствия мутации
Экзоны 44 и 46 присоединяются, но не совмещаются
Шаг 3 Какой экзон необходимо пропустить?
Экзон 44?
Таким образом, пропуск экзона 44 может быть решением
Экзон 46?
Таким образом, пропуск экзона 46 также может быть решением
Пример 3: точечная мутация в экзоне 43Шаг 1 Обозначаем мутацию
Шаг 2 Последствия мутации
Вследствие точечной мутации в экзоне 43 форма экзона изменяется таким образом, что он уже не может быть совмещен с экзоном 44
Таков эффект большинства точечных мутаций в экзоне
Шаг 3 Какой экзон необходимо пропустить
Экзон 43?
Однако экзоны 42 и 44 не совмещаются, так что пользы от этого нет
Экзон 42 и 43?
Они также не совмещаются, так что и это – не решение
Экзоны 43и 44?
Таким образом, для исправления этой мутации необходимо удалить как экзон 43, так и 44
Почему для пропуска экзона так важно знать мутацию?
Пропуск экзонов – мутаций-специфичная методика. Поэтому если мутация неизвестна, невозможно определить, применима ли методика пропуска экзона и какой экзон должен подвергнуться пропуску
Пропуск экзонов применим ко всем мутациям, нарушающим генетический код?
Нет, это не так. Как вы можете видеть на рисунке ниже, некоторые участки протеина дистрофин, как полагают, особенно важны для его функционирования (красная область). Мутации в этой области вызывают миодистрофию Дюшенна независимо от того, нарушают они генетический код или нет, и пропуск экзонов, таким образом, вряд ли будет иметь положительный эффект у пациентов, имеющих мутации, затрагивающие эту красную область (экзон 1, экзоны 64-70)
Другие участки видимо важны относительно, поскольку у пациентов с МД Беккера, имеющих мутации в оранжевом (экзоны 2-10) и желтом (экзоны 71-78) участках течение болезни более тяжелое, чем у пациентов с мутациями в зеленом (экзоны 10-63) участке. К счастью, область «горячих» мутаций (наиболее частых, экзоны 44-55) локализована в зеленом участке
Кроме того, для некоторых редких типов мутаций, таких как крупные дупликации и транслокации, на настоящий момент скорректировать генетический код слишком сложно
Работает ли пропуск экзонов у пациентов с МД Беккера?
Нет. Цель пропуска экзонов – обеспечить синтез Беккеро-подобного дистрофина, так что эта методика неприменима к пациентам/мутациям с МД Беккера. Возможно в будущем пропуск экзонов сможет быть применим для конвертирования некоторых мутаций, дающих более тяжелое течение МД Беккера, в мутации для более мягкого ее течения
Каким будет клинический эффект пропуска экзонов?
Пока мы этого не знаем, поскольку эта терапия проходит только клинические испытания. Цель же этого направления – конвертировать МД Дюшенна в МД Беккера, так что мы надеемся добиться замедления, а возможно – и остановки прогрессирования заболевания
Сможет ли пропуск экзонов восстановить уже утраченные мышцы?
Полагаем, что нет. Пропуск экзонов использует продукт гена дистрофина, а он синтезируется только мышечной тканью, но не фиброзной, которая замещает мышечную на поздних стадиях заболевания
Можно ли применять эту терапию к пациентам, уже прикованным к креслу-коляске?
Во первых, пропуск экзонов еще исследуется, проходя клинические испытания, и пока терапией не является. Не следует ожидать, что пропуск экзонов сделает пациентов — колясочников снова ходячими. Однако мы надеемся, что это поможет замедлить или даже остановить разрушение еще сохранившейся мышечной ткани, в частности – мышцы рук
Почему проходящие клинические испытания направлены на пропуск именно 51 экзона?
Пропуск 51 экзона применим к большой группе пациентов (~13% всех пациентов) По этой причине именно такой антисмысловой олигонуклеотид (АОН) был разработан первым. Если все пойдет хорошо, вскоре появятся АОН-ы и для других экзонов (уже проходят испытания по пропуску 44 экзона – прим. Garry)
Почему в клинических исследованиях участвует лишь небольшое число пациентов? Не было бы более справедливым включить в исследования большее их количество?
Мы надеемся, что однажды пропуск экзонов станет терапией, но вначале мы должны эту методику испытать. Пожалуйста имейте в виду, что клинические испытания – это не лечение. Мы вынуждены начинать с небольшого количества пациентов, чтобы подтвердить безопасность и эффективность потенциальной терапии. Таким образом, участие в клинических испытаниях не исключает риска и не гарантирует положительного терапевтического эффекта
Как мой сын может стать участником клинических испытаний?
Клинические испытания проводятся компаниями Prosensa Therapeutics и GSK. Сами компании напрямую не набирают пациентов, это делается через специалистов центров клинических исследований. Поскольку проводимые в настоящее время исследования – это небольшие исследования с целью подтверждения безопасности препарата, они проводятся с участием относительно небольшого количества пациентов, живущих недалеко от исследовательских центров. Для будущих более широких исследований пациенты могут набираться через международные базы данных (таких как регистр пациентов TREAT-NMD DMD, объединяющий локальные регистры пациентов по всему миру)
У каждого исследования есть критерии отбора, основанные как на том, какой препарат исследуется (в случае с пропуском экзона 51 пациенты должны иметь мутации, поддающиеся исправлению посредством пропуска именно этого экзона), так и на том, какие параметры оцениваются (например – состояние мышц, их функциональность и т.п.)