Регенерация скелетных мышц имеет важное клиническое значение при мышечных дистрофиях и различных травмах, и зависит от камбиального резерва, формируемого клетками-миосателлитами. Как формирующие скелетное мышечное волокно миобласты, так и клетки-миосателлиты образуются из единых мышечных предшественников с высоким пролиферативным потенциалом [2]. После завершения формирования мышечного волокна во время эмбрионального развития скелетной мышцы клетки-миосателлиты располагаются вне многоядерного волокна и остаются пролиферативно-неактивными. Выживание и распространение этих клеток основано на экспрессии транскрипционного фактора Pax7 [2].
Исследования in vitro подтверждают важную роль Pax7 в процессах выживания миобластов, их пролиферации и установлении миогенного фенотипа [1-2]. Также было показано, что в покоящихся клетках-миосателлитах наблюдается постоянная экспрессия Pax7 [3]. Основываясь на этих данных, исследователи из отдела эмбриологии института Карнеги Christoph Lepper и Chen-Ming Fan решили проверить гипотезу о том, что влияние Pax7 ответственно за самообновление и вызванную травмами регенерацию скелетных мышц in vivo.
В опубликованном в журнале Nature исследовании была прослежена судьба миосателлитов с инактивированным геном Pax7 у мышей. Инактивация происходила в результате Cre-опосредованной рекомбинации двух аллельных вариантов гена Pax7: Pax7f и Pax7СЕ. Были использованы мыши линии Rosa26, характеризующиеся экспрессией lacZ после Cre-опосредованной рекомбинации. Зависящая от тамоксифена активность CreERT2 подтверждалась ?-галактозадазной активностью.
В результате, на 5 и 10 сутки после травмы, вызванной кардиотоксином, у гетерозиготных по аллельным вариантам гена Pax7 (Pax7+/СЕ) мышей на 60-90 сутки после рождения все мышечные волокна, полученные в результате регенерации, оказались ?-гал+. Это показывает, что основным источником регенерирующих волокон являются потомки клеток, экспрессирующих Pax7. Оказалось неожиданным, что и у мышей с полностью выключенным геном Pax7 миофибриллы регенерировали, причем в волокнах не было обнаружено ни мРНК Pax7, ни самого белка Pax7. Таким образом, функциональный белок Pax7 не требуется для регенерации скелетных мышц после травмы во взрослом возрасте.
У мутантов Pax7-/- в зародышевой линии, напротив, после травмы регенерировали лишь редкие тонкие волокна. Более того, считается [4], что эти фибриллы имеют иное, не Pax7-зависимое, происхождение. У таких мутантов выжившие изолированные клетки не обладали типичными характеристиками миосателлитов. Исследователи провели анализ судьбы клеток, участвующих в регенерации миофибрилл у таких мутантов, используя в качестве метки 5-этинил-2’-дезокксиуридин, и обнаружили, что потомки клеток Pax7— не только формируют волокно, но и занимают нишу клеток-сателлитов.
Наиболее вероятными кандидатами для функциональной замены Pax7 в данном случае являются другие представители семейства Pax. Известно, что Pax3 и Pax7 могут замещать друг друга в эмбриональном миогистогенезе [1]. Для проверки гипотезы о возможном замещении Pax7 на Pax3 во время процесса мышечной регенерации у взрослых мышей исследователи выключили оба гена. Оказалось, что ни Pax7, ни Pax3 не влияют на регенерацию скелетных мышц у взрослых организмов.
Следующей задачей исследования стало определение критического периода влияния Pax7 на регенерацию in vivo.
В результате оказалось, что регенерация мышечных фибрилл перестает быть зависимой от клеток-потомков Pax7+ предшественников после 21 суток постнатального развития. Именно на этом сроке развития завершается формирование «архитектурного облика» мышечного волокна, распределяются ядра, и обособляются молчащие клетки-миосателлиты [5]. Потомки клеток-мутантов по Pax7, напротив, сливались в фибриллу только после 31 суток постнатального развития.
Схема эксперимента Lepper et. al. по Wang и Conboy
А: Авторы исследования сконструировали две аллели гена Pax7: Pax7f (c сайтом loxP на фланге экзона 2) и Pax7СЕ (промотор Pax7 запускает экспрессию белка из двух субъединиц: тамоксифен-индуцируемая Cre-рекомбиназа/рецептор эстрогена (CreER). У мышей с обеими аллелями в клетках с активным промотором Pax7 происходит индуцируемая тамоксифеном делеция в экзоне 2 гена Pax7, что приводит к сдвигу рамки считывания и появлению стоп-кодона в экзоне 3. Получающаяся в результате молчащая аллель обозначается Pax7?.
Б: Индуцируя Cre-рекомбинацию и выключая экспрессию Pax7 у мышей различного возраста было определено, что Pax7 важен для миогенеза у эмбрионов и ювенильных мышей до 21 суток, но не оказывает влияния на регенерацию мышц у взрослых животных.
Результатами своего исследования авторы считают, в первую очередь, открытие факта, что белок Pax7 функционально не только координирует выживание и пролиферацию клеток-миосателлитов, но и предотвращает их дифференцировку и слияние в мышечное волокно, сохраняя потенциал к регенерации у клеток-миосателлитов. Также был определен критический период зависимости от Pax7 во время перехода от миосателлитоцитов к состоянию стволовых клеток, обеспечивающих скелетным мышцам способность к регенерации. Этот период у мышей заканчивается на 21 сутки после рождения. Показана неотъемлемая роль Pax3 и Pax7 для эмбриональных мышечных предшественников, и роль только одного Pax7 для перинатальных. Совершенно неожиданно оказалось, что взрослые клетки-сателлиты не нуждаются ни в Pax3, ни в Pax7 для осуществления процессов мышечной регенерации.
Авторы серьезно пошатнули господствующую концепцию о том, что «регенерация повторяет развитие». Изменения в генетической программе мышечных стволовых клеток при переходе от эмбриональной стадии к ювенильной и далее к стадии взрослого организма подталкивает к осторожности в применении знаний, полученных при эмбриональных исследованиях, к биологии стволовых клеток взрослых. Зависимые от возраста изменения в свойствах стволовых клеток убеждают в необходимости тщательного анализа возраста клеточного материала, используемого при трансплантациях в регенеративной медицине.
По материалам:
http://www.celltranspl.ru/news/newspost77