Цель этого обзора — информировать пациентов и родителей о разрабатываемых в настоящее время для МДД различных терапевтических направлениях, рассказать о преимуществах и недостатках каждого метода и трудностях, которые необходимо преодолеть до того, как эти методы станут доступны пациентам
Подробные обзоры, написанные Dr G?nter Scheuerbrandt, можно найти здесь на английском, немецком и испанском языках.
Проблема
Мышечная дистрофия Дюшенна обусловлена мутациями (генетическими «ошибками»), нарушающими код гена дистрофина. В норме на основе этого гена в мышечных клетках синтезируется протеин дистрофин, связывающий каркас мышечных волокон с защитным слоем на внешней поверхности волокон. Эта связь стабилизирует мышечные волокна в процессе мышечных сокращений. Образно можно представить все это в виде якоря (мышечный каркас) и лодки (защитный слой снаружи), где дистрофин — связывающий их канат.
Вследствие нарушения генетического кода в клетках может синтезироваться только начальный участок протеина, и связующая функция теряется (лодка больше не свзана с якорем) В результате мышечные волокна при МДД очень легко повреждаются, даже во время обычных сокращений. Мутации в дистрофиновом гене, не нарушающие генетический код, приводят к синтезу частично функционального дистрофина (т.е. лодка и якорь связаны, но эта связь несколько короче) Такие мутации ассоциированы с более мягкой мышечной дистрофией Беккера.
Разработка новых терапевтических подходов
Существует несколько терапевтических направлений, и большинство проходят путь от преклинических до клинических исследований. Вначале метод опробуется на культурах клеток пациентов, затем — на животных моделях (в основном это т.н. mdx-мыши), и только потом, когда результаты на клеточных культурах и животных достаточнмо убедительны — на пациентах (клинические исследования) Эта часть разработки той или иной методики может занимать очень продолжительное время, поскольку часто возникают непредвиденные препятствия, которы необходимо преодолеть. Клинические исследования разделяются на две основные фазы: ранняя стадия испытания проводится для того, чтобы показать безопасность метода, в то время как более поздняя стадия должна продемонстрировать, что метод так же эффкетивен, как и безопасен
Генотерапия
Цель: Доставить здоровый ген в мышечные клетки и восстановить нормальный синтез дистрофина
Базис: Гены — это последовательности ДНК и локализованы на хромосомах, которые находятся в ядрах всех клеток. Дистрофиновый ген содержит генетический код для дистрофина, который может быть «прочитан» клеткой и транслирован в синтез дистрофина
Проблема 1: Мышцы состоят из миллиардов клеток, и здоровый ген должен быть доставлен по крайней мере в 20% из миллиардов ядер мышечных клеток
Решение: К счастью, есть организмы, которые очень хороши для введения генов в клетку — вирусы. Таким образом, сфера генотерапии — разработать вирусный вектор, из которого удален генный материал самого вируса, что освободит место для нового гена, а сам вирус уже не будет патогенным
Проблема 2: Большинство вирусов предпочитают инфицировать делящиеся клетки. Мышечные клетки делятся очень неактивно, поэтому для вирусов они нежелательная цель. Вдобавок, мышечные волокна обернуты слоями соединительной ткани, улавливающей вирусные частицы, и вирусы не в состоянии доставить ген дистрофина в мышечную ткань
Решение: Есть вирусы, которые довольно хорошо инфицируют мышечные клетки, это так называмые адено-ассоциированные вирусы (AAV) Эти вирусы могут инфицировать клетки человека, но они не патогенны (не вызывают заболеваний)
Проблема 3: К сожаления, AAV настолько малы, что дистрофиновый генетический код в них не помещается (целый ген слишком велик, больше примерно в 500 раз, а генетический код — примерно в 4 раза)
Решение. Ученые попытались создать минимально возможный дистрофин, включающий только самые необходимые участки (микро-дистрофин) Генетический код микро-дистрофина достаточно мал для того, чтобы быть упакованным в AAV вектор. В мышиной модели МДД (mdx-мыши) обработка микродистрофином, упакованным в AAV-вектор, привела к улучшению функций и качества мышц
Проблема 4: Когда этот метод был опробован на собачьей модели (золотистые ретриверы с мышечной дистрофией, или GRMD), он вызвал иммунный ответ. Следствием этого стало то, что клетки, инфицированные AAV, содержащими микро-дистрофин, были уничтожены иммунной системой. Клинические исследования на людях с другими генами (например для лечения гемофилии) показали, что AAV вызывают иммунный ответ и у людей. Иммунный ответ направлен на любые чужеродные организмы (вирусы, бактерии, паразиты), и в настоящее время не существует способов «убедить» иммунную систему, что вирус несет в себе «хороший» ген
Решение: В настоящее время разрабатываются спсобы ослабить иммунный ответ. Это может быть достигнуто либо подавлением иммунного ответа, либо поиском менее иммуногенных подтипов AAV (существует множество подтипов этих вирусов)
Клинические исследования: Первые клинические исследования, в которых пациентам был ин’ецирован AAV-микродистрофин локально в мышцу руки были проведены в США (Mendell, Xiao Xiao и Samulski). Результаты этого исследования обрабатываются.
Будущее: Подготавливливаются более масштабные испытания, в которых будет осуществлена обработка одной или нескольких мышц руки или ноги AAV-микродистрофином
Клеточная терапия
Цель: Доставить мышечные клетки здоровых доноров (содержащие здровый ген) в поврежденные мышцы для компенсации утерянной мышечной ткани и восстановления нормального синтеза дистрофина донорскими клетками
Базис: Мышцы состоят из неделящихся мышечных волокон, и мышечных стволовых клеток, расположенных на их внешней поверхности. Когда мышечное волокно повреждается, эти стволовые клетки (называемые также сателлитными, или миобластами) начинают делиться и сливаются с мышцами для их восстановления. Эти стволовые клетки могут быть выделены из мышечных биоптатов, культивированы в лабораторных условиях, и трансплантированы пациентам с МДД
Проблема 1: Мышечные стволовые клетки неспособны мигрировать из кровотока в мышцы
Решение: Локальные ин’екции непосредственно в поврежденные мышцы
Проблема 2: Клетки, ин’ецированные непосредственно в мышцы, не мигрируют далее 1-2 мм от места введения иглы (сайта ин’екции)
Решение: Выполнение множественных ин’екций (около 100 на кв. см). Это было протестировано на пациентах с Дюшенна, и дистрофин-позитивныв клетки действительно наблюдались в сайтах ин’екции
Проблема 3: Все же практически неосуществимо использовать такую форму обработки для доставки мышечных клеток во все мышцы тела
Решение: Существую стволовые клетки, находящиеся в крови, стенках кровеносых сосудов и жировой ткани, так же способные участвовать в формировании мышц. Эти клетки могут быть выделены и культивированы в лабораторных условиях. Преимущество состоит в том, что эти клетки вероятно способны мигрировать из кровотока в мышцы, таким образом делая возможной обработку по всему телу
Проблема 4: Хотя эти клетки способны участвовать в формировании мышц, эффективность этого в настоящее время очень мала (<1% трансплантированных клеток оседают в мышцах)
Будущее: В настоящее время разрабатываются методы улучшения эффективности этого метода. Многообещающие результаты были получены на мышиных и собачьих моделях при использовании «мезангиобластов» (группа Giulio Cossu) и клеток «CD133+» (группа Ivan Torrente).
Проблема 5. Трансплантация донорских клеток вызывает иммунный ответ (подобно трансплантации любой ткани в другой организм)
Решение а: Применение препаратов, подавляющих иммунную систему (иммунодепрессантов) Это стандартная процедура для пациентов, получающих донорские ткани. К сожалению, непрерывная иммуносуппрессия связана с побочными эффектами (например один из многих — подверженность инфекциям)
Решение b: Выделение мышечных клеток у самих пациентов, культивация и обработка (например — посредством генотерапии) их в лабораторных условиях. Далее возврат собственных клеток пациента обратно (т.н. аутологичная трансплантация). Генотерапия в клетках в лабораторных условиях гораздо более эффективна, чем непосредственно в ткани в организме пациента. Кроме того, поскольку используются собственные клетки пациента, нет необходимости в иммуносуппрессии.
Проблема 6: Возможно, иммунная система все же будет реагировать на трансплантированные клетки несмотря на то, что это клетки самого пациента: в результате лабораторных манипуляций клетки видимо изменятся, и иммунная система может их задержать. Кроме того, вначале должны быть оптимизированы способы эффективной доставки в мышцы мышечных, или любых других, стволовых клеток (смотри проблемы 1-4)
Клинические исследования: Клинические исследования, в которых мышечные клетки были введены посредством 100 ин’екций в небольшую область мышцы (0,25-1 кв. см) были проведены в Канаде (Tremblay and Skuk). Обработка была безопасной и дистрофин позитивные волокна было возможно детектировать в биоптате, полученном из обработанной области мышцы.
Исследование, в котором клетки CD133+ были получены у пациентов с Дюшенна (выделены из крови), культивированы в лаборатории и затем трансплантированы в мышцу руки пациентам, были проведены в Италии (Torrente)
Продолжается подготовка клинических испытаний с донорскими мезангиобластами (Cossu)
Медикаментозная терапия
Цель: Использовать препараты для воздействия на различные аспекты патологии болезни
Базис: Вследстие утраты дистрофина мышечные волокна пациентов постоянно повреждаются в процессе сокращений. Утраченная мышечная ткань замещается соединительной (этот процесс носит название «фиброзис») Этот процесс — необратим, к тому же усугублен иммунным ответом, спровоцированным повреждением мышц. Лекарства могут помочь усилить рост мышц, чтобы скомпенсировать утрату мышечной ткани, или же могут подавлять иммунную систему, или препятствовать формированию соединительной ткани.
Недостаток: Медикаменты воздействуют только на симптомы заболевания, но не на его причину. Подавляющее большинство из них дают лишь временный эффект по задержке прогрессирования заболевания
Преимущество: В основном лекарства принимаются перорально и воздействуют на все мышцы тела (т.е. нет тех проблем с доставкой, как при генной или клеточной терапии) Иногда препараты, применяемые для лечения других заболеваний, могут быть использованы и для лечения пациентов с МДД. Это ускоряет их внедрение в клиническую практику, поскольку уже известна некоторая информация об этих препаратах (например — токсичность, дозировки и т.д.)
Есть большое количество препаратов, которые по общему мнению имеют эффект у пациентов с МДД и/или на мышиных моделях. Ниже описаны некоторые из тех, что были протестированы на пациентах, либо показали многообещающие результаты на мышиной модели
Препараты, протестированные на пациентах
Кортикостероиды (преднизолон, дефлазакорт и т.п.)
Цель: Подавление иммунной системы для ослабления формирования соединительной ткани
Базис: Кортикостероиды — это группа препаратов, способных подавлять иммунную систему. Когда мышечная ткань повреждается — это вызывает иммунный ответ (организм не «знает» о причине повреждения — это вполне может быть вирус, бактерия и т.п.) В то же время, пока иммунный ответ наиболее интенсивен (дабы защитить организм от инфекции), иммунная система усиливает тяжесть заболевания. Иммунные клетки выделяют токсичную субстанцию (чтобы уничтожить бактерии и т.п.), которая спсобствует усилению разрушения мышц и ускорению формирования соединительной ткани. Подавлением иммунной системы с помощью кортикостероидов можно добиться менее тяжелого повреждения мышечной ткани, и ослабить интенсивность формирования соединительной ткани.
Клинические исследования: Было проведено не так много исследований для сравнения пациентов, принимающих кортикостероиды, с теми, кто их не принимает, или сравнения разных кортикостероидов (например преднизолона с дефлазакортом), однако по общему мнению кортикостероиды замедляют прогресирование заболевания. Это позволяет оттянуть необходимость в применении инвалидного кресла примерно на 1-3 года, временно улучшить силу и функцию мышц, и замедлить ухудшение респираторной функции. Пока стероиды используются не очень продолжительное время, поэтому невозможно оценить, помогут ли они увеличить продолжительность жизни
Вполне вероятно, что кортикостероиды работают не только как иммунодепрессанты (предполагается, что они могут усилить экспрессию атрофина и/или стабилизировать мышечные волокна, а также ослабить чувствительность мышц к повреждениям) Пока все это исследуется. Однако тот факт, что другие препараты, только подавляющие иммунную систему, менее эффективны, чем кортикостероиды, косвенно подтверждает эту идею.
Проблема: Прием кортикостероидов должен быть регулярным и постоянным. Это вызывает побочные эффекты у большинства пациентов. Наиболее частые из них — рост веса, депрессия, поведенческие проблемы, задержка роста, замедление полового созревания, утрата костной массы и многие другие
Решение 1а: Большинство пациентов могут ослабить побочные эффекты применением дискретного режима приема. Например — принимая через неделю, или только по будним дням, исключая выходные. У некоторых пациентов меньшие побочные эффекты наблюдаются при приеме дефлазакорта вместо преднизолона
Решение 1b: Некоторые пациенты не переносят постоянный прием кортикостероидов. Если побочные эффекты перевешивают пользу (например, рост веса настолько серьезный, что сводит на нет улучшение функции мышц), возможно лучшим решением будет прекратить прием кортикостероидов (естественно, такое решение должно быть принято после консультации с лечащим врачом)
Циклоспорин
Цель: Подавление иммунной системы для ослабления формирования соединительной ткани
Базис: Циклоспорин — иммунодепрессант. Следовательно справедливо все то, что было сказано в секции кортикостероидов
Клинические испытания: В Германии (Korinthenberg) были проведены клинические исследования для оценки пользы применения циклоспорина у пациентов. К сожалению, не обнаружилось никакой разницы между пациентами, принимавшими и не принимавшими
циклоспорин
Идебенон
Цель: Замедлить формирование соединительной ткани главным образом в сердечной мышце
Базис: Вследствие утраты дистрофина скелетные и сердечная мышцы находятся под воздейстием постоянного стресса (т.н. оксидативного стресса), который является еще одним процессом, способствующим формирования соединительной ткани. В скелетных мышцах это приводит к ухудшению их функций. В сердце результатом становится ухудшение его перекачивающей функции (сердце становится «тугим») Цель применения идебенона — уменьшить оксидативный стресс (идебенон — антиоксидант) главным образом в сердечной мышце, замедлив тем самым развитие фиброза. Таким образом, кардилогические проблемы, характерные для большинства взрослых пациентов, могут быть замедлены или даже предотвращены
Клинические исследования: Проведенные компанией Santhera (Thomas Meier, Switzerland) исследования применения идебенона у пациентов с МДД показали его безопасность. К настоящему времени полностью завершено расширенное исследование фазы II, в котором исследовались эффекты (безопасность и эффективность) при более длительном применении, а также подготавливается исследование фазы III, для которого сейчас набираются участники
Препараты в стадии разработки
Активация атрофина
Цель: Повысить уровни гомолога дистрофина — атрофина, в мышцах
Базис: Атрофин — это протеин, очень похожий на дистрофин, и образует такую же связь между цитоскелетом и соединительной тканью, как и дистрофин, однако преимущественно в немышечных тканях. В мышцах он экспрессируются в очень маленьких дозах и в основном находится в месте передачи сигналов от нервов и мышцам (нервномышечное соединение). У пациентов и животных моделей с МДД атрофин тем не менее синтезируется в мышцах. У пациентов эти повышенные уровни все же слишком малы, чтобы иметь эффект. Исследования же на мышах показали, что более высокие уровни атрофина могут функционально компенсировать утраченный дистрофин и замедлить развитие заболевания.
В генах имеется «переключатель интенсивности», который управляется специальными протеинами. Ген может быть либо «выключен», либо может быть установлена большая или меньшая его активность в различных тканях (что соответственно приводит к повышенному или пониженному уровню соответствующего протеина) Ген атрофина настроен на очень малый уровень в мышцах. Был произведен скрининг тысяч химических соединений для поиска тех, которые могли бы настроить ген атрофина на более высокий уровень в мышцах
Клинические исследования: Препараты, способные усилить экспрессию атрофина в культурах клеток и у животных моделей были идентифицированы Summit PLC (John Tinsley and Kay Davies, UK), BioMarin Pharmaceutical Inc. и PTC Therapeutics. Подготавливаются клинические исследования
Ингибирование миостатина
Цель: Увеличение мышечной массы путем снижения уровней природного регулятора роста мышц — миостатина
Базис: Есть факторы, которые улучшают формирование мышц, и факторы, которые блокируют их формирование (Далеко не все ткани используют мышцы, и поскольку мышцы потребляют много энергии, их об’ем должен быть не больше, чем это небходимо) Миостатин — как раз один из факторов, блокирующих рост мышц (он снижает уровни многих генов, связанных с мышцами). Когда ген протеина миостатина поврежден, либо миостатин не синтезируется, это приводит к увеличению мышечной массы у животных (бельгийские голубые коровы, овцы, охотничьи собаки, мыши) и людей. Таким образом, если заблокировать миостатин, это должно улучшить формирование мышц. Это могло бы скомпенсировать утрату мышечной массы при МДД и может быть достигнуто антителами к миостатину (протеинами, способными специфически связывать другие протеины) Они связывают миостатин, блокируя его доступ к генам, и снижая его об’ем
Клинические исследования: Миостатиновые антитела были испытаны на здоровых добровольцах и показали безопасность. Затем они были испытаны на взрослых пациентах с мышечными заболеваниями. Хотя обработка показала безопасность, не было отмечено увеличения мышечной массы у пациентов. Впрочем, испытание длилось всего 28 дней, что возможно является недостаточно продолжительным
Будущее: Компанией Acceleron идентифицировано новое антитело к миостатину, которое превосходит ранее идентифицированные антитела в мышиной модели МДД. Это антитело в настоящее время испытывается на здоровых добровольцах (результаты ожидаются). Если обработка будет безопасной, будут проведены испытания с участием пациентов с МДД (планируется на 2010 год)
Проблема: Ингибирование миостатина приводит к росту мышечных стволовых клеток (сателлитных клеток) В условиях непрерывного разрушения мышц у пациентов с МДД число этих клеток снижено, и ингибирование миостатина может привести к исчерпанию пула мышечных стволовых клеток (т.е. состоянию, когда не останется стволовых клеток и мышцы более не смогут восстанавливаться, как раньше) Однако пока нет четкой уверенности в таком развитии событий
Мутаций-специфичные методы
PTC124 и гентамицин
Применимость: Эти препараты работают только у пациентов с мутациями, приводящими к образованию «стоп-сигнала» Такие мутации составляют примерно 15% всех случаев МДД. Также эти препараты возможно применять и для других заболеваний, вызванных мутациями с образованием преждевременный стоп-кодонов, например — кистозного фиброза (муковисцидоза)
Цель: Побудить клетку игнорировать преждевременный стоп-кодон и синтезировать польнофункциональный дистрофин
Базис: Во всех генах есть стартовые сигналы и стоп-сигналы, которые клеточные машины для трансляции генов в синтез протеинов распознают как сигналы для начала и окончания синтеза. Иногда небольшая мутация может привести к образованию стоп-сигнала внутри гена (дополнительно к существующему в конце гена) Нормальный стоп-сигнал в основном несколько отличается от этого мутантного стоп-сигнала (как например стоп-сигнал на бойком перекрестке (нормальный стоп-сигнал) и стоп-сигнал посреди скоростного шоссе (мутантный стоп-сигнал) Однако клетка реагирует на стоп сигнал и преждевременно прекращает синтез протеина. Существут препараты, которые запрещают использование это мутантного стоп-кодона, но никак не влияют на нормальный стоп-кодон. Первым из таких препаратов был идентифицирован и испытан в культурах клеток и мышиной модели МДД гентамицин (антибиотик из класса аминогликозидов)
Клинические исследования: Гентамицин был протестирован на пациентах с МДД, однако не показал достоверного восстановления дистрофина
Проблема: В дополнение к низкой эффективности, гентамицин токсичен при длительном применении (может повреждать слух и почки)
Решение: Проверка большого количества препаратов позволила идентифицировать препарат, так же способный убедить клетку игнорировать преждевременный стоп-кодон, не вызывая при этом побочных эффектов. Этот препарат, разработанный PTC Therapeutics (USA) — PTC124 или ataluren®. Он может применяться перорально и приводит к восстановлению дистрофина в культурах клеток и мышиных моделях МДД
Клинические исследования: PTC124 продемонстрировал безопасность у здоровых добровольцев. Было проведено первое испытание с МДД пациентами. Пациенты получали PTC124 ежедневно в течение 4 недель в разных дозах. Обработка была хорошо переносима пациентами, и было отмечено восстановление дистрофина при применении более высоких доз. Исследование, направленное на выяснение, будут ли функциональные улучшения при более длительном применении, в настоящее врема готовится в нескольких центрах в США и Европе.
Пропуск экзонов
Цель: Скорректировать генетический код для синтеза частично функционального дистрофина
Базис: Генетический код рассредоточен по т.н. экзонам. Когда необходимо синтезировать протеин, вначале формируется временная копия (РНК). До того, как начнется трансляция РНК в протеин, экзоны нужно состыковать, перед этим удалив перемежающиеся с ними некодирущие последовательности (интроны) Этот процесс носит название сплайсинг
У пациентов с МДД генетический код в гене дистрофина нарушен, что приводит к досрочному прекращению трансляции гена в протеин. У пациентов с МДБ мутации не нарушают генетический код, и синтезируется частично функциональный дистрофин
Цель пропуска экзонов — восстановить генетический код у пациентов с МДД для синтеза Беккеро-подобного частично функционального дистрофина взамен нефункцинального Дюшенновского. Это достигается применением т.н. AON-ов (антисмысловых нуклеотидов) AON — короткие участки модифицированной РНК, способные опознавать целевой экзон, связывать его и скрывать от «машины», осуществляющей сплайсинг. Это приводит к пропуску целевого экзона и восстановлению генетического кода.
Эта методика индуцировала пропуск экзонов и синтез укороченного дистрофина в культурах клеток и в мышиных моделях, при этом у мышей это сопровождалось и функциональными улучшениями.
Разработаны различные типы AON-ов
Применимость: Для восстановления генетического кода при различных мутациях и типах мутаций необходимо пропускать различные экзоны. Поскольку у большинства пациентов присутствуют мутации, расположенные в «горячих» участках, пропуск определенных экзонов применим к большему числу пациентов, чем пропуск других экзонов.
Хотя пропуск экзонов применим к основным мутациям, все же существуют исключения
Проблема 1: Пропуск экзонов не может быть опробован на здоровых добровольцах, поскольку пропуск экзонов, восстанавливающий генетический код у пациентов, будет нарушать генетический код у здоровых людей (потенциально вызывая у них МДД)
Клинические исследования: Проведены первые клинические исследования, в которых проводились ин’екции AON для пропуска экзона 51 в мышцу голени 4 пациентов с МДД (Prosensa and LUMC) Синтез дистрофина был локально восстановлен у всех пациентов
Проблема 2: Мышцы составляют примерно 30% массы тела, таким образом невозможно проводить ин’екции во все существующие мышцы
Решение: В результате болезни мышцы пациентов и мышей становятся проницаемыми (поврежденными) Хотя AON-ы не могут поступать из кровотока в здоровые мышцы, в поврежденные — могут. Таким образом в данном случае само заболевание помогает лечению. Поэтому внутривенные или подкожные ин’екции приводят к широкомасштабному пропуску экзонов и восстановлению дистрофина
Клинические исследования: Подготавливаются клинические испытания, в которых будут проводиться внутривенные или подкожные инекции различных доз AON-ов типов 2OMePS или PMO соответственно.
Проблема 3: AON-ы для пропуска различных экзонов считаются регилирующими органами различными препаратами. Это означает, что разработка AON-ов для раличных экзонов — очень дорога и продолжительна по времени, поскольку каждый из них должен пройти все стадии преклинических и клинических исследований
Решение: Есть надежда, что разработка пойдет быстрее после первых 2-3-х. Исследователи находятся в тесном контакте с регулирующими органами, чтобы как можно скорее решить все вопросы
by Annemieke Aartsma-Rus
Взято: miopatia.ru