Небольшое исследование на больных мышечной дистрофией Дюшенна собаках показало, что CRISPR-система, нацеленная на ген дистрофина, и введенная в составе аденоассоциированного вируса в мышцы или кровь, эффективно восстанавливает экспрессию белка в скелетных мышцах и сердце. Результаты испытания опубликованы в Science.
Миодистрофия Дюшенна развивается у одного из 3600 мальчиков в результате мутаций в гене DMD, кодирующем белок . Больные рано утрачивают способность ходить и к 20-30 годам умирают от сердечной или легочной недостаточности.
Ген DMD очень большой и состоит из множества кодирующих кусочков (экзонов). Выпадение некоторых из них в процессе в ряде случаев приводит к нарушению рамки считывания гена и синтезу укороченного нефункционального белка. Известно, что у 13 процентов больных рамку считывания гена можно восстановить путем удаления 51 экзона. Этот подход, который назвали «пропуском экзонов» (exon skipping), пока считается самым перспективным в генотерапии дистрофии Дюшенна. Американское управление по контролю за продуктами и лекарствами в 2016 году препарат этеплирсен, который представляет собой короткий олигонуклеотид, удаляющий 51 экзон путем рекомбинации. Однако испытания на людях показали, что экспрессия белка при этом восстанавливается на уровне менее одного процента от нормы.
Ученые из Университета Техаса, компании Exonics Therapeutics и Королевского ветеринарного колледжа Лондона под руководством Эрика Олсона (Eric Olson) реализовали ту же идею при помощи CRISPR-системы, состоящей из белка Cas9 и направляющей РНК против 51 экзона (посмотреть, как работает система редактирования генома CRISPR-Cas9, можно в ). Модельным организмом стали собаки породы бигль, у которых от природы встречается та же мутация, что и у 13 процентов больных людей. Кроме того, симптомы болезни у собак напоминают таковые у человека и включают в себя кардиомиопатию, которая не развивается, например, у мышей. Таким образом авторы хотели подтвердить эффективность работы системы на крупных животных, что приблизило бы разработку терапии для людей.
Leonela Amoasii et al / Science 2018
В качестве средства доставки CRISPR-системы ученые использовали аденоассоциированный вирус AAD9, который имеет повышенное сродство к мышечной ткани. ДНК, кодирующую Cas9 и направляющую РНК, вводили в организм собак в составе двух разных вирусных частиц. В первом эксперименте двум щенкам в икроножную мышцу ввели вирусные частицы и через шесть недель оценили восстановление мышечной ткани. Оказалось, что в подопытной мышце большинство волокон экспрессирует дистрофин, а суммарно его синтез восстановился на 60 процентов от нормы. В то же время в соседних мышцах экспрессия дистрофина составляла не более двух процентов от нормы.
В следующем эксперименте двум щенкам ввели вирусные частицы в кровь – одной собаке в той же концентрации, что ранее вводили в мышцу, а второй в десять раз больше. Через восемь недель в первом случае количество белка достигло в разных скелетных мышцах от трех до 50 процентов от нормы, а во втором – от пяти до 90 процентов. Максимальная экспрессия дистрофина в этом случае наблюдалась в сердечной мышце.
Leonela Amoasii et al / Science 2018
Несмотря на успешные испытания, результат которых намного превзошел эффективность терапии олигонуклеотидом, авторы признают, что для оценки реальной эффективности CRISPR -терапии нужны долговременные исследования на большем количестве животных, которые покажут, в течение какого времени нужная экспрессия белка поддерживается в мышцах.
CRISPR не раз предлагали использовать для терапии миодистрофии Дюшенна. Так, ранее та же исследовательская группа из университета Техаса универсальный набор направляющих РНК для пропуска экзонов для редактирования клеток сердечной мышцы. А эффективность редактирования, сопровождающегося восстановлением правильной последовательности гена, удалось увеличить более чем на порядок, упаковав CRISPR-систему в .