Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) представляет собой тяжелое моногенное нарушение, вызванное дефектом в дистрофине, белке, важном для работы скелета и мышц.
В противоположность этому заболеванию при мышечной дистрофии Беккера демонстрируются более слабые по сравнению с МДД симптомы, и это вызвано внутренними делециями, не меняюшими рамку считывания белка дистрофина. Таким образом, присутствовал значительный интерес при развитии методов, направленных на восстановление рамки считывания дистрофина, с целью создания этих «схожих с Беккером» белков. Новые терапевтические методы лечения на основе маленьких молекул и олигонуклеотидов были разработаны для выборочного устранения или «пропуска» экзонов, без которых можно обойтись, из продукта гена дистрофина с целью коррекции рамки считывания, а также с целью выработки внутренне делеционного, но функционирующего белка дистрофина.
Однако, к этим подходам, вероятно, потребуется применить меры постоянного административного контроля с целью поддержания терапевтической эффективности. Редактирование генома с использованием генно-инженерных энзимов, таких как нуклеаза белкового домена «цинковые пальцы» (цинк-пальцевая нуклеаза (ZFN), представляет собой новое терапевтическое воздействие с потенциалом к постоянной коррекции генетических мутаций, вызывающих заболевания; что схоже с целями, преследуемыми при пропуске экзонов. Для того чтобы это продемонстрировать, мы разработали дюжины цинк-пальцевых нуклеаз (ZFN) при помощи Расширенного модельного скопления (eMA) и Контекстно-зависимого скопления (CoDA), нацеленных на экзон 51 гена дистрофина.
Это осуществляется с целью корректировки являющихся причиной МДД мутаций путем посредничества при хромосомной делеции экзона 51, когда тем самым осуществляется постоянное «пропускание» экзона и целевого добавления коротких последовательностей к экзону 51 путем гомологической рекомбинации с целью восстановления рамки считывания. После первичного эписомного экрана пять ZFN от eMA и семь ZFN от CoDA были протестированы на активность редактирования гена на эндогенном гене дистрофина. Из них один ZFN от eMA, направленный на экзон 51, и три ZFN от CoDA, направленных на интрон 50 и экзон 51, продемонстрировали изменение до ?6% аллелей в иммортализованных человеческих МДД скелетных миобластах.
Совместная трансфекция двух ZFN была направлена на интрон 50 и экзон 51 в МДД клетки, что привело к делеции промежуточной хромосомной последовательности, как это было обнаружено посредством анализа полимеразной цепной реакции всей делеции локуса. Эта удаленная область включает 5′ акцепторных сайтов сплайсинга экзона 51, вероятно, тем самым вызывая постоянное исключение экзона 51 из транскрипта дистрофина. Целевое добавление небольшого, корректирующего рамку ДНК-тэга в экзон 51 произошло при показателе до 6% аллелей после применения по отношению к пациенту с МДД лечения с помощью клеток с экзоном 51-связывающим ZFN и плазмида- или одноцепочного донора, в основе которого лежит олигонуклеотид.
Кроме того, клональные популяции клеток пациентов с МДД были изолированы, что привело к сдерживанию ожидаемой генетической делеции или присоединения в экзон 51. Данные эксперименты будут направлены на определение количества частоты делеции основного объема популяции посредством количественной ПЦР (полимеразной цепной реакции – qPCR), оценки потенциального нецелевого воздействия и исследования восстановления экспрессии дистрофина в этих клональных популяциях путем Вестерн-блота и имплантации в скелетную мышцу у иммунодефицитных мышей. Эти данные свидетельствуют о том, что редактирование генома с помощью ZFNs может быть мощным инструментом для создания постоянной делеции экзона или предварительно определенных вставок, способных осуществить коррекцию искаженных рамок считывания.
Источник: МойМио