Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) моногенное и смертельное генетическое расстройство,которое характеризуется потерей мышечной масс и способности передвигаться, и смерти в возрасте 20 из-за потери функционального дистрофина — важнейшего опорно-двигательного белка. Генная терапия принесла обещание для лечения моногенных заболеваний, однако, препятствия доставки и требования к дорогостоящим повторяющимся процедурам представляют некоторые проблемы технологий. Недавно разработанная CRISPR / Cas9 система была адаптирована для редактирования генома. Эта технология позволит постоянные корректировки генома и потенциально лечебный подход при МДД.
Ранее мы адаптировали CRISPR / Cas9 для целевых делеций регионов гена дистрофина человека, которые восстанавливают экспрессию функционального белка. Доставка Cas9 с одной направляюей РНК (sgRNAs) ориенирована на интроы окружающие экзоны 51 и 45-55 для созданния двойных разрывов ДНК, которые отремонтированы создать геномные делеции в этих регионах. Эти делеции восстанавливают рамку считывания и приводят к экспрессии дистрофина в культурах клеток пациентов.
Этот подход может быть использован для преобразования смертельного фенотипа МДД к более мягким фенотипам, связанного с наличием частичной функции дистрофина как примышечной дистрофии Беккера.
Здесь мы используем аденоассоциированный вирус (AAV) для доставки CRISPR системы / Cas9 в модели MDX мыши. AAV векторы были разработаны, чтобы упаковать и доставить гены, кодирующие Cas9 (SaCas9), из-за меньшего размера (3,2 кб) по сравнению с широко используемыми Cas 9. Две отдельные направляющие РНК (sgRNAs) были предназначены для целевых сайто вокруг экзона 23 гена дистрофина и проверены, чтобы направить SaCas9-опосредованное удаление этого экзона, который содержит преждевременный стоп-кодон в этой модели. Мышей анестезировали и AAV1 содержащие кассеты экспрессии SaCas9 и sgRNA вводили в икроножную мышцу 8-недельных мышей. Через 4 и 8 недель после инъекции собрали икроножные мышцы и геномная ДНК и РНК были извлечены. ПЦР из геномной ДНК показал ожидаемое ~1200 п.о. удаление экзона 23. Кроме того, ОТ-ПЦР из извлеченной мРНК показали удаление 216 п.о., кодирующей экзон 23. Кроме того, sgRNAs совместимые с SaCas9 были разработаны и проверены для удаления человеческого экзона 51.
Эта работа показывает,что принцип CRISPR / Cas9-опосредованного редактирования генома в скелетных мышцах у взрослого млекопитающего открывает новые возможности для генной терапии и исследования функции генов. Оптимизация доставки и деятельности ведется для улучшения терапевтического потенциала этого подхода. Дополнительная работа, чтобы охарактеризовать функциональное улучшение в задней конечности мыши также продолжается. Эта работа устанавливает CRISPR /Cas9-опосредованное редактирование генома в качестве потенциального терапевтического подхода к МДД.
http://www.distrofiamuscular.net
Источник МойМио