Рейтинг@Mail.ru
Молекулярная неврология. Заболевания нервно-мышечной  системы

Молекулярная неврология. Заболевания нервно-мышечной системы

12222Описание: В мировой литературе имеются расхождения в названии многих моногенных болезней, существуют определенные трудности в их клинической диагностике, а некоторые редкие заболевания, выделяемые в самостоятельные формы лишь на базе молекулярно-генетического анализа, отечественным специалистам практически неизвестны. С учетом этого в большинстве случаев после названия каждого описываемого заболевания мы указали его энциклопедический номер (MIM), соответствующий составленному В. Мак-Кьюсиком каталогу генов и моногенных болезней человека («Mendelian inheritance in man. Catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes»). Исключение составляют только те заболевания, которые были выделены в самостоятельные нозологические формы после выхода последнего издания каталога в 1997 г. Номера MIM позволяют, на наш взгляд, избегать путаницы в определении конкретного моногенного заболевания. Обозначения генов также соответствуют каталогу В. Мак-Кьюсика. В большинстве случаев рядом с названием гена в скобках мы даем расшифровку его обозначения, подчеркивая те буквы, которые входят в аббревиатуру.

В монографии «Молекулярная неврология» использована одна из универсальных систем обозначения мутаций, рассчитанная на запись аминокислотных замен в белках. При этом каждая аминокислота обозначается однобуквенным символом. Расположенный в центре номер соответствует месту замены в цепочке первичного продукта трансляции, слева записывается нормальный вариант аминокислоты, справа — мутантный. Например, запись C283Y означает замену цистеина на тирозин в 283 положении белка. Так записываются различные варианты аминокислотных замен при миссенс мутациях. Буквой X обозначается место остановки синтеза полипептидной цепи при нонсенс мутациях. Например, запись R49X означает прекращение трансляции на месте аргинина в 49 положении белка.
Книга «Молекулярная неврология» адресована врачам-неврологам, педиатрам, медицинским генетикам, преподавателям и учащимся медицинских вузов, а также слушателям факультетов усовершенствования врачей, специализирующимся в области неврологии. Чтение монографии требует знания основ молекулярной генетики человека в объеме учебных пособий — В. Н. Горбунова, В. С. Баранов «Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний» (СПб.: «Специальная », 1997) или В. Н. Горбунова «Молекулярные основы медицинской генетики», (СПб.: «Интермедика», 1999). Для облегчения восприятия материала книга снабжена словарем генетических терминов, составленным в алфавитном порядке.

Год выпуска: 2000

Автор: Горбунова В.Н., Савельева-Васильева Е.А., Красильников В.В.

Жанр: Неврология

Формат: PDF

Качество: OCR

Скачать книгу: «Молекулярная неврология»

——————————————————

УДК 616-055.5/7:577.2

ББК Р252.215

Горбунова В.Н., Савельева-Васильева Е. А., Красильников В. В. Молекулярная неврология.Часть 1. Заболевания нервно-мышечной системы. СПб, «Интермедика», 2000 — 320 стр.

ISBN 5-89720-026-2

Предлагаемая читателю обзорная монография является одной из первых попыток систематизации накопленной к настоящему времени информации в области молекулярной неврологии. Первая часть монографии посвящена анализу молекулярно-генетических основ нервно-мышечных заболеваний. Основное внимание в книге уделено тем наследственным болезням нервной системы, для которых расшифрована природа первичного молекулярного дефекта. После клинического описания каждого заболевания, подробно представлена история картирования и идентификации мутантного гена, дана его молекулярная характеристика; описаны типы и распростанённость мутаций, идентифицированных у пациентов, с указанием используемых в клинической практике методов молекулярной диагностики данного патологического состояния; дан обзор существующих модельных генетических линий животных. Особое внимание уделено описанию первичного биохимического дефекта, лежащего в основе патогенеза заболевания. Рассмотрены подходы к разработке патогенетических методов терапии, включая генную терапию. Книга адресована врачам, преподавателям и студентам, специализирующимся в области неврологии, а также педиатрам и медицинским генетикам. Монография может быть использована в качестве справочного руководства при составлении специализированных учебных циклов по молекулярной неврологии для студентов медицинских вузов и слушателей системы последипломного образования.

© В.Н. Горбунова

О Оформление «Интермедика»

ISBN 5-89720-026-2

Посвящается памяти основателя отечественной нейро/енетнки академика

Сергея Николаевича Да виден ко ва

При подготовке рисунков 1, 2, 4, 5, 16, 17, 18 и 19 использовали Color atlas of genetics (Passarge E., 1995). Рисунок 7 подго­

товлен по иллюстрациям двух статей (Nigro et al., 1996; Vainzof et al.f 1996). Рисунок 9 взят из работы (Chamberlain J.S., 1999). Рисунки 10 и 11 любезно предоставлены профессором В. С. Барановым. При подготовке рисунков 12 и 13 использовали работы (Bonnemann et al., 1996) и (McNally et al., 1996), соответственно. Рисунок 15 взят из работы (Nowak et al., 1999). Рисунок 20 подготовлен по работе (Harris et al., 1996). Рисунок 21 подготовлен по работе (Bulman D. Е., 1997). Рисунки 22 и 23 взяты из работы (Tanaka et al., 1996).

 

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ                                                                              11

Глава 1

БОЛЕЗНИ МЫШЦ.

МЫШЕЧНЫЕ ДИСТРОФИИ

         И МИОПАТИИ                                                                  19

1.1. Общая характеристика                                                          19

1.2. Миодистрофия Дюшенна/Беккера

и дюшенно-подобные

             аутосомно-рецессивные миопатии                                   зо

а) Псевдогипертрофическая мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера (MIM: 310200) 31

  1. 1.   Клиническая характеристика заболевания      31
  2. 2.   Картирование и идентификация гена DMD      34
  3. 3.   Мутации в гене DMD и их диагностика               36 4. Структура и функции дистрофина      44
    1. 5.   Регуляция транскрипции и сплайсинга гена DMD,

апо-дистрофины 49

  1. 6.   Дистрофин-ассоциированный комплекс белков          53

                   7   Анализ корреляций генотип-фенотип. Дюшенно-подобные

                         аутосомно-рецессивные миопатии                                               59

  1. 8.      Семейство DMD-родственных генов               67
  2. 9.      Линии мышей, моделируюшие миодистрофию

                         Дюшенна/Беккера                                                                             72

  1. 10.    Генотерапия миодистрофии Дюшенна/Беккера          80

б) Мышечная дистрофия врожденная прогрессирующая с умственной отсталостью,

                   тип Фукуяма (MIM: 253800)                                             85

1.3. Конечностно-поясные мышечные дистрофии                     87

а) Миодистрофия конечностно-поясная аутосомнодоминантная, типы: 1A (MIM:159100); 1В; 1С; аутосомно-рецессивная, типы: 2A(MIM:253600); 2В (MIM:253601); 2С (MIM:253700); 2D (ОМ1М:600119);

                   2Е (OMIM:600900); 2F (OMIM: 601400)                     88

  1. 1.      Общая генетическая характеристика   89
  2. 2.      Конечностно-поясная миодистрофия, аутосомно-

доминантная, форма LGMD1C 90

  1. 3.      Конечностно-поясная миодистрофия, аутосомно-

рецессивная, форма LGMD2A 91

  1. 4.      Конечностно-поясная миодистрофия, аутосомно-

рецессивная, форма LGMD2B 93

  1. 5.      Конечностно-поясная миодистрофия, аутосомнорецессивная, формы LGMD2C-2F (саркогликанопатии) ….95

6) Мышечная дистрофия плечевого и тазового пояса с буллезным эпидермолизом (MIM: 226670) 100

1.4. Лице-лопаточно-плечевая мышечная дистрофия

Ландузи-Дежерина (MIM: 158900) 102

1.5. Миодистрофии, обусловленные дефектами белков

            ядерной ламины (эмеринопатии)                                     107

а) Мышечная дистрофия с контрактурами, тип Эмери-Дрейфуса, Х-сцепленная (MIM: 310300)…. 108

  1. 1.     Клиническая характеристика заболевания       108
  2. 2.     Картирование и идентификация гена EMD 108 3. Структура гена STA и типы мутаций 110 4. Структура и функции эмерина 112

                5.    Лопаточно-перонеальные синдромы (SP- синдромы)            114

        б)    Скапуло-илио-перонеальная атрофия с кардиопатией

                 (MIM: 181350)                                                                  115

1.6. Врожденные непрогрессирующие

миопатии 117

        а)   Мышечная дистрофия врожденная

                 мерозин-дефицитная (MIM: 156225)                              118

        б)   Миопатия врожденная, обусловленная

                 недостаточностью а 7 интегрина Ы D                           121

в) Нитчатая (немалиновая) миопатия, тип 1 (MIM: 161800); тип 2 (MIM: 256030) 122

  1. 1.       Клиническая характеристика заболевания      122
  2. 2.       Роль а-актинина и а-тропомиозина в патогенезе

немалиновой миопатии 123

  1. 3.       Молекулярные основы аутосомно-рецессивной медленно

                        прогрессирующей немалиновой миопатии                               125

  1. 4.       Актиновая миопатия 126

г) Болезнь центрального стержня (MIM: 117000) 130 д) Миотубулярная миопатия (MIM: 310400) 132 е) Миопатия Бетлема (MIM: 158810) 137

1.7. Миопатии с цитоплазматическими

и ядерными включениями

          в мышечных клетках                                                          140

б) Миопатия дистальная с накоплением десминовых включений (MIM: 125660).

Десмин-родственная миопатия (OMIM: 601419)

в) Миопатия с инклюзионными тельцами, аутосомно-доминантная (MIM: 147420);

144

аутосомно-рецессивная (OMIM: 601073)

146

          а) Миопатия окулофарингеальная (MIM: 164300)               141

1.8. Митохондриальные миопатии                                            147

а) Миопатии митохондриальные с делециями и дупликациями митохондриальной ДНК (MIM: 550000,

160550); синдром Кернса-Сейра (MIM: 530000) 154

1.9. Метаболические миопатии                                                  157

а) Гликогеноз 5 типа, гликогеноз мышечный, Мак-Ардла

болезнь (MIM: 232600) 158

б) Миопатия с дефицитом карнитин пальмитоилтрансферазы I (MIM: 255110) 160 в) Миопатия напряжения (MIM: 102770) 161

г) Миопатия, обусловленная недостаточностью

                  фосфоглицератмутазы (MIM: 261670)                           162

ГЛАВА 2 БОЛЕЗНИ МЫШЦ.

МИОТОНИЧЕСКИЕ СИНДРОМЫ

           И ПЕРИОДИЧЕСКИЕ ПАРАЛИЧИ                         165

2.1. Общая характеристика                                                        165

2.2. Миотонические синдромы 169 а) Миотоническая дистрофия (MIM: 160900) 169

 

                 1    Клиническая характеристика заболевания                                   169

  1. 2.  Картирование и идентификация гена DM              170
  2. 3.  Молекулярная природа мутаций в гене DM          170
  3. 4.  Механизмы экспансии CTG-повтора в гене DM   173
  4. 5.  Биохимическая характеристика продукта гена DM             174
  5. 6.  Молекулярные основы патогенеза

                       миотонической дистрофии                                                              176

7 Характеристика других генов, участвующих

                        в патогенезе миотонической дистрофии                                    178

               8. Модельные линии животных                                                              179

Ь) Врожденная миотония Томсена (MIM: 160800), болезнь

                  Беккера (MIM: 255700)                                                     181

2.3. Периодические параличи 185

а) Периодический паралич II, гиперкалиемического типа

                  (MIM:170500; 168300; 168350; 170600)                              185

б) Периодический паралич I, гипокалиемического типа

                 (MIM: 170400)                                                                    188

в) Периодический паралич III, нормокалиемического типа

                 (MIM: 170600)                                                                    190

ГЛАВА 3

БОЛЕЗНИ С ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫМ

ПОРАЖЕНИЕМ ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО

ДВИГАТЕЛЬНОГО НЕВРОНА 191

3.1. Общая характеристика                                                          191

3.2. Спинальные мышечные атрофии                                        198

а) Проксимальные детские спинальные мышечные атрофии. Тип 1, болезнь Верднига-Гоффмана (MIM: 253300). Тип 2, промежуточный (MIM: 253550). Тип 3, мягкая спинальная амиотрофия Кугельберга-Веландер

                 (MIM: 253400)                                                                   199

  1. 1.     Клиническая характеристика заболевания       199
  2. 2.     Картирование гена SMA и генетическая характеристика

                         SMA-области                                                                                       206

  1. 3.     Идентификация и молекулярная характеристика

гена SMN 208

  1. 4.     Идентификация мутаций у пациентов со спинальной

                        мышечной атрофией                                                                         210

  1. 5.     Характер экспрессии гена SMN             211
  2. 6.     Функции белка выживания двигательных нейронов 213

                7      Молекулярная диагностика спинальной

                        мышечной атрофии                                                                           215

                8.    Вклад в патогенез спинальных мышечных атрофии других

                       генов, расположенных в SMA-области                                         216

        б)   Спинально-бульбарная мышечная атрофия, болезнь

                 Кеннеди (MIM: 313200)                                                     219

3.3.      Наследственные полинейропатии                                   225

        а)   Болезнь Шарко-Мари-Тус тип IB (MIM: 118200;

                 159440; 145900)                                                                229

б) Болезнь Шарко-Мари-Тус тип IA (MIM: 118220; 145900); нейропатия наследственная со склонностью к

развитию парезов вследствие сдавления ствола

                 нерва (MIM: 162500)                                                         231

  1. 1.     Картирование гена СМТ1А     231
  2. 2.     Молекулярно-генетическая характеристика

СМТ1А-области 231

  1. 3.     Нейропатия наследственная со склонностью к развитию парезов вследствие сдавления ствола нерва 233
  2. 4.     Идентификация гена РМР22   234
  3. 5.     Мутации в гене РМР22              236
  4. 6.     Генетические модели болезни

                        Шарко-Мари-Тус IА типа                                                                  237

        в)   Х-сцепленная моторная и сенсорная нейропатия

                   (MIM: 302800 -304040;302801; 302802; 310490)                 238

г) Болезнь Шарко-Мари-Тус, нейронального типа II (MIM: 118210, 600882,158580, 601472) 241

д) Нейропатия Шарко-Мари-Тус, тип IV (MIM: 214400; 601382; 601596) 242

         е)   Наследственная сенсорная нейропатия,

                 тип1(М1М: 162400)                                                           244

3.4. Боковой амиатрофический склероз

           (MIM: 105400)                                                                        245

  1. 1.     Клиническая характеристика заболевания       245
  2. 2.     Метаболизм глутамата при боковом амиотрофическом

склерозе 247

СЛОВАРЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ТЕРМИНОВ                      зоз

 

ВВЕДЕНИЕ

В последние десятилетия достигнуты впечатляющие успехи в области молекулярной генетики человека, позволившие от формального описания генов и менделевских законов наследования перейти к их детальной идентификации. Определена организация основных элементов генома человека, построены подробные цитогенетические карты, являющиеся основой для выявления, изоляции и анализа индивидуальных генов человека. Проведено секвенирование полной нуклеотидной последовательности молекулы ДНК человека, длина которой достигает 3.5 миллиарда пар оснований. Это означает, что в ближайшие годы будут открыты все гены человека, число которых по разным оценкам составляет от 80 до 100 тысяч. В настоящее время известна цитогенетическая локализация около 30 ООО генов человека и расшифрована молекулярная природа более 10 000 этих генов. Около 1000 из них связаны с моногенными наследственными заболеваниями.

Открытие гена означает не только нахождение в геноме человека определенного участка ДНК, собственно и яв­

ляющегося геном, но обязательную изоляцию и определение нуклеотидной последовательности полноразмерной кодирующей области гена, так называемой молекулы комплементарной ДНК (кДНК). Клонирование кДНК, то есть ее введение в бактериальную или дрожжевую систему, позволяет по­

лучать неограниченное количество копий этой молекулы и осуществлять различные манипуляции in vitro, направленные на расшифровку структурной и функциональной организации гена. Именно клонированная кДНК получила название «гена в пробирке». Определение экзон-интронной структуры гена, ответственного за развитие определенного наследственного заболевания, и секвенирование нуклеотидной последовательности его кодирующих и регуляторных областей создают основы для молекулярной идентификации мутаций у пациентов и разработки программ, направленных на профилактику данного состояния на базе досимптоматической и пренатальной диагностики. Кроме того, знание нуклеотидной последовательности гена позволяет прогнозировать аминокислотную последовательность кодируемой полипептидной цепи и реконструировать третичную структуру, доменную организацию и функциональные свойства белка, являющегося первичным биохимическим дефектом при соответствующем наследственном заболевании. Небольшие фрагменты этого белка могут быть получены путем искусственного синтеза полипептидных молекул или путем клонирования кодирующих участков гена в экспрессионных системах. В дальнейшем эти фрагменты могут быть использованы для конструирования антител, с помощью которых проводится не только исследование тканеспецифического распределения белкового продукта гена в норме и при патологии, но также изоляция этого белка в препаративных количествах для прямого биохимического анализа. Таким образом, открытие гена создает реальные предпосылки для изучения молекулярных основ этиологии и патогенеза наследственного заболевания, а также для разработки патогенетических методов терапии.

Идентификации гена человека часто предшествует описание гомологичного гена у экспериментальных животных, в частности у мышей. И наоборот, если гомологичный ген мыши не был известен, его идентификация проводится вскоре после описания соответствующего гена человека. На следующем этапе появляется возможность искусственного конструирования модельных линий трансгенных животных путем направленного разрушения гомологичного гена в ранних зародышах мышей («нокаут») или введения в этот ген специфических мутаций. Отбор особей, содержащих модифицированный ген в зародышевых клетках, и последующая се­

лекционная работа завершаются созданием генетической линии животных со специфическими мутациями в заданном гене. Подобные трансгенные линии мышей являются очень удобными обьектами для изучения молекулярных и биохимических основ патогенеза наследственных заболеваний человека, а также для разработки специфических методов предупреждения и лечения таких состояний.

Одним из важнейших итогов проводимых исследований является определение молекулярных основ клинической и генетической гетерогенности. Оказалось, что один и тот же клинический фенотип может быть обусловлен мутациями в разных генах. С другой стороны, различные мутации одного и того же гена могут приводить к различному течению забо­

левания и даже реализоваться в нозологически самостоятельные типы болезней, образующие так называемые аллельные серии. В настоящее время точная диагностика, а значит профилактика и терапия многих наследственных болезней возможна только с учетом данных молекулярно-генетического анализа.

Эти положения могут быть проиллюстрированы на примере многих сотен наследственных заболеваний. Данная монография посвящена описанию молекулярно-генетических основ наследственных болезней нервной системы. Монография состоит из пяти частей, каждая из которых будет выпущена в виде отдельного издания. При делении материала на части мы руководствовались не только клиническими, но так­

же и молекулярно-генетическими принципами. Первая часть посвящена заболеваниям нервно-мышечной системы и включает: болезни мышц —мышечные дистрофии, миопатии, миотонические синдромы и периодические параличи, а также заболевания с преимущественным поражением периферического двигательного неврона — проксимальные спинальные мышечные атрофии, полинейропатии, боковой амиатрофический склероз. В настоящее время известно более 5000 моногенных заболеваний. В значительном проценте случаев моногенные болезни сопровождаются различными дефектами нервной системы. Разумеется, рамки настоящего издания не позволяют остановиться на всех наследственных заболеваниях с поражением нервной системы. Основное внимание будет уделено тем болезням, для которых мутантные гены уже открыты и расшифрована природа первичного мопекулярного дефекта. Мы коротко остановимся на клинике каждого из этих заболеваний, подробно опишем историю картирования и идентификации гена, ответственного за развитие заболевания, представим его молекулярную характеристику, типы и распространенность мутаций, идентифицированных у пациентов, методы молекулярной диагностики данного состояния, дадим обзор существующих модельных генетических линий животных. Особое внимание будет уделено описанию первичного биохимического дефекта, лежащего в основе патогенеза заболевания; в тех случаях, когда это возможно, остановимся на разрабатываемых программах генной терапии.

Краткость клинического описания рассматриваемых заболеваний обусловлена существованием в отечественной литературе достаточного количества посвященных этим вопросам монографий, руководств и обзоров (Давиденков, 1925; Калмыкова, 1976; Гехт, Ильина, 1982; Бадалян и др., 1988; Гринио, Агафонов, 1997; Лобзин и др., 1998; Вельтищев, Темин, 1998). Однако во всех этих изданиях практически отсутствуют сведения о молекулярно-генетических основах заболеваний нервной системы. Наиболее полно генетические аспекты освещены в руководстве по наследственным болезням нервной системы, выпущенном в 1998 году под редакцией академика РАМН Ю. Е. Вельтищева и профессора П. А. Темина. Современный обзор по молекулярным основам прогрессирующих миодистрофий опубликован в журнале Неврологии и психиатрии им. С. С. Корсакова (Иллариошкин, Иванова-Смоленская, 1998). Тем не менее в целом сведения по молекулярной неврологии в русскоязычной литературе носят чрезвычайно фрагментарный характер. В то же время молекулярная неврология — это одна из наиболее динамично развивающихся областей медицинской генетики, в которой накоплен огромный фактический материал. Этот материал, по нашему мнению, достаточен для определенных обобщений. Мы не претендуем на полноту охвата всех исследований, проводимых в области молекулярной неврологии, но постарались отразить основные тенденции в развитии этой науки. Большая часть результатов, изложенных в данной монографии, имеет фундаментальное значение, хотя часть сведений может устареть уже к моменту выхода книги из печати.

В мировой литературе имеются расхождения в названии многих моногенных болезней, существуют определенные

трудности в их клинической диагностике, а некоторые редкие заболевания, выделяемые в самостоятельные формы лишь на базе молекулярно-генетического анализа, отечественным специалистам практически неизвестны. С учетом этого в большинстве случаев после названия каждого описываемого заболевания мы указали его энциклопедический номер (MIM), соответствующий составленному В. Мак-Кьюсиком каталогу генов и моногенных болезней человека («Mendelian inheritance in man. Catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive, and X-linked phenotypes»). Исключение составляют только те заболевания, которые были выделены в самостоятельные нозологические формы после выхода последнего издания каталога в 1997 г. Номера MIM позволяют, на наш взгляд, избегать путаницы в определении конкретного моногенного заболевания. Обозначения генов также соответствуют каталогу В. Мак-Кьюсика. В большинстве случаев рядом с названием гена в скобках мы даем расшифровку его обозначения, подчеркивая те буквы, которые входят в аббревиатуру.

В монографии использована одна из универсальных систем обозначения мутаций, рассчитанная на запись аминокислотных замен в белках. При этом каждая аминокислота обозначается однобуквенным символом (табл. 1). Расположенный в центре номер соответствует месту замены в цепочке первичного продукта трансляции, слева записывается нормальный вариант аминокислоты, справа — мутантный. Например, запись C283Y означает замену цистеина на тирозин в 283 положении белка. Так записываются различные варианты аминокислотных замен при миссенс мутациях. Буквой X обозначается место остановки синтеза полипептидной цепи при нонсенс мутациях. Например, запись R49X означает прекращение трансляции на месте аргинина в 49 положении белка.

Таблица 1

Символы аминокислот

Аминокислоты

Трехбуквенный

Однобуквенный

символ

символ

Алании

Ala

A

Аргинин

Arg

R

Аспарагин

Asn

N

Аспарагиновая кислота

Asp

D

Asn и/или Asp

Asx

В

Цистеин

Cys

С

Глутамин

Gin

Q

Глутаминовая кислота

Glu

E

Gin и/или Glu

Glx

Z

Глицин

Gly

G

Гистидин

His

H

Изолейцин

He

I

Лейци

Leu

L

Лизин

Lys

К

Метионин

Met

M

Фенилаланин

Phe

F

Пролин

Pro

P

Серин

Ser

S

Треонин

Thr

T

Триптофан

Trp

w

Тирозин

Tyr

Y

Валин

Val

V

Книга адресована врачам-неврологам, педиатрам, медицинским генетикам, преподавателям и учащимся медицинских вузов, а также слушателям факультетов усовершенствования врачей, специализирующимся в области неврологии. Чтение монографии требует знания основ молекуляр-

 

ной генетики человека в объеме учебных пособий — В. Н. Горбунова, В. С. Баранов «Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний» (СПб.: «Специальная литература», 1997) или В. Н. Горбунова «Молекулярные основы медицинской генетики», (СПб.: «Интермедика», 1999). Для облегчения восприятия материала книга снабжена словарем генетических терминов, составленным в алфавитном порядке.

 

 

Глэвэ 1

БОЛЕЗНИ МЫШЦ. МЫШЕЧНЫЕ ДИСТРОФИИ И МИОПАТИИ

1.1. Общая характеристика

, в основе которых лежит первичное нарушение мышечной ткани, объединены в большую группу, именуемую миопатиями. В основе клиники лежит атрофия мышц, мышечная слабость, снижение глубоких рефлексов. Типичны системность поражения поперечно-полосатых мышц и прогрессирующий характер течения заболевания. Миопатии — наиболее часто встречающаяся патология в большой группе наследственных нервно-мышечных заболеваний. Будучи сходными по клиническим признакам, миопатии являются разнородными заболеваниями, отличающимися типом наследования, особенностями мышечного метаболизма, иногда специфическими изменениями структуры мышечного волокна. Сходство клинических проявлений миопатии, в первую очередь, относится к особенностям передвижения больных, их типичной походке, моторике верхних конечностей, туловища, обусловленных начальным вовлечением в патологический процесс мышц тазового и плечевого пояса, проксимальных отделов конечностей, туловища. Атрофии мышц, сопровождающиеся прогрессирующей мышечной слабостью, постепенно усиливаются, вовлекая в симметричный процесс всё новые мышечные группы. Дегенеративные изменения, происходящие в мышечной ткани, ведут к развитию мышечных и сухожильных ретракций, усиливающих Деформации конечностей. Особенно опасны для жизни больного поражения сердечной мышцы и мускулатуры, участвующей в процессе дыхания. Сходство клинической картины миопатии относится только к кардинальным признакам. Каждое из нозологически самостоятельных заболеваний имеет клинические особенности, позволяющие с достаточной точностью установить диагноз.

19

За последние годы в изучении наследственной мышечной патологии отмечены существенные сдвиги, благодаря внедрению современных методов анализа тонкой структуры мышечной ткани и особенностей ее метаболизма. Но наиболее значительные успехи связаны с разработкой современных генетических технологий, позволяющих осуществлять поиск и идентификацию дефектных генов с последующей возможностью проведения молекулярной диагностики мутаций у пациентов и описанием первичных биохимических нарушений, лежащих в основе развития патологических процессов. В свете этих достижений более оптимистичными представляются подходы к рациональному лечению некоторых форм миопатии, включая перспективы использования генной терапии.

Общим свойством генов, дефектных при миопатиях, является их экспрессия в скелетных мышцах. С использованием современных молекулярно-генетических технологий построена предварительная карта генов, экспрессирующихся в скелетных мышцах человека (Pallavicini et al., 1997). В процессе построения этой карты были идентифицированы 1945 индивидуальных генов, 725 из которых не имели гомологии с уже известными генами человека. Затем была определена хромосомная локализация 267 этих неизвестных генов. Кроме того, для построения геномного транскрипционного профиля скелетных мышц человека была использована информация о положении на карте дополнительных 242 экспрессирующихся последовательностей^ соответствующих известным генам. Оказалось, что некоторые гены кластерированы на разных хромосомах. Хромосомы 17, 19, 21 и X значительно обогащены генами, экспрессирующимися в мышцах, по сравнению с другими хромосомами. Избирательная концентрация экспрессирующихся генов в некоторых хромосомах и в специфических районах отдельных хромосом может быть обусловлена существованием батарей генов, нахо-

20

дящихся под контролем одних и тех же механизмов, принимающих участие в регулировании тканеспецифической экспрессии генов.

В табл. 2 представлены данные по локализации генов, ответственных за наследственные миопатии, указаны первичные биохимические дефекты и дана краткая функциональная характеристика этих белков.

Таблица 2 Молекулярно-генетическая характеристика наследственных миодистрофий и миопатии

Нозологическая форма,

MIM

Ген,

локализация

Белок, функции

Миодистрофия Дюшенна;

-Беккера, Х-сцепленная,

310200

DMD

Хр21.2

дистрофии — сарколеммный белок цитоскелета, связывающий актин с экстракле­

точным матриксом через дистрофин-ассоцииро-

ванный комплекс белков;

аподистрофины

Миодистрофия врожденная, прогрессирующая с умственной отсталостью, тип Фукуяма, аутосомно-

рецессивная, 253800

FCMD, MUSC?

9q31-q33

рецепторная тирозинкиназа?

Миодистрофия конечностно-поясная, аутосомно-

доминантная 1А,     159100

LMNB1?

5q22.3-q31.3

ламин В1? белок ядерной ламины

Миодистрофия конечностно-поясная, аутосомнодоминантная 1В

LMNA?

1q11-q21

ламин А/С? белок ядерной ламины

Миодистрофия конечностно-поясная,

аутосомнодоминантная 1С

CAV3

Зр25

кавеолин-3 — дистрофинассоциированный белок

мышечных кавеол

Миодистрофия конечностно-поясная, аутосомно-

рецессивная 2А, 253600

CAPN3

15q15.1-q21 1

кальпаин-3 — мышечная протеаз

 

Миодистрофия конечностно-поясная,

аутосомно-рецессивная 2В,                253601; миопатия

дистальная Миоши,

254130

DYSF, ММ

2р13.3-2р13.1

дисферлин — цитоплазмат

ческий белок, взаимодей­

ствующий с ядерной и

плазменными мембранами

Миодистрофия конечностно-поясная,

аутосомно-рецессивная 2С, 253700

SGG, ySG

13q12

у-саркогликан белок дистрофинассоциированного

комплекса

Миодистрофия конечностно-поясная, аутосомно-рецессивная 2D, 253700; первичная адхалинопатия, 600119 ADL, DAG2, SGA, ctSG

17q21

а-саркогликан, адхалин белок дистрофинассоциированного

комплекса

Миодистрофия конечностно-поясная, аутосомно-рецессивная 2Е, 600900

SGB, PSG

4q12

р-саркогликан —

белок дистрофинассоциированного

комплекса

Миодистрофия конечностно-поясная, аутосомно-рецессивная 2F,

601411

SGD, 8SG

5q33

8-саркогликанбелок дистрофинассоциированного комплекса

Миодистрофия плечевого и тазового пояса с буллезным эпидермолизом, аутосомнорецессивная,226670

PLEC1

8q24.13-qter

плектин — белок соединяющий цитоскелет

клетки с мембраной

Лице-лопаточно-плечевая миодистрофия ЛандузиДежерина, аутосомнодоминантная IA, 158900

FSHD1

4q35-qter

Миодистрофия Эмери-

Дрейфуса,

Х-сцепленная, 310300

EMD, STA

Xq28

эмерин — ядерный ламинаассоциированный белок
Миодистрофия ЭмериДрейфуса, аутосомнодоминантная, 181350

EDMD-AD,

LAMA

1q11-q23

ламин А/С- белок

ядерной ламины

Миодистрофия врожденная мерозин-дефицитная, аутосомно-рецессивная,

156225

LAMA2

6q22-q23

мерозин, ламинин 2 —

белок базальной ламины, связанный с дистрофинассоциированным

комплексом белков

Миопатия врожденная, интегрина7рЮ-

дефицитная, аутосомно-

рецессивная

ITGA7

12q13

интегрин p1D, ot7 — рецептор ламинина 2
Миопатия немалиновая, волокнистая, аутосомнорецессивная, 256030

NEB

2q21.2-q22

небулин — интегральный компонент тонких и толстых нитей саркомера
Миопатия немалиновая, волокнистая, аутосомнодоминантная, 161800

NEM1, TPM3

1q23-q25.1

тропомиозин-3 — главный белковый компонент латеральных Z-дисков
Миопатия немалиновая, аутосомно-доминантная; миопатия актиновая

АСТА1

1q42

а-актин — основной белковый компонент тонких нитей саркомера

Болезнь               центрального стержня; злокачественная гипертермия, аутосомно-доминантная,

117000

RYR1 19q12-q13.2

рецептор 1 рианодина кальций высвобождающий канал саркоплазматического ретикулума скелетных мышц
Миопатия миотубулярная 1, Х-сцепленная, 310400

MTM1, CG2

Xq28

миотубулярин — мышечная тирозин-серин-фосфатаза

Миопатия Бетлема, аутосомно-доминантная,

158810;

(120220; 120240; 120250)

COL6A1,

COL6A2

COL6A3,

21q22.3, 2q37

а 1, 2 и 3 субьединицы микрофибриллярного кол­

лагена VI типа мышц,

выполняющего роль моста между клетками и внеклеточным матриксом.

Миопатия окулофарингеальная, аутосомнодоминантная, 164300

OPMD,

PABP2

14q11.2-q13

поли(А)-связывающий белок 2

Миопатия дистальная с накоплением десмин вых включений, аут сомно-доминантная,

125660

DES 2q35

десмин — белок семейства

промежуточных филамент

типа III

Миопатия десминРодственная, аутосомно-

Доминантная,601419

CRYA

11q21-q23

аВ-кристаллин — мажорный белок хрусталика,

присутствующий в мышцах

Миопатия с инклюзионными тельцами, аутосомно-рецессивная,

601073

IBM2 9p1-q1

МакАрдла болезнь, аутосомно-рецессивная; гликогеноз V типа, 232600

PYGM

11q13

фосфорилаза

мышечная

Миопатия, обусловленная СРТ-дефицитом аутосомно-рецессивная; гипераммониемия 255110

СРТ1 1р13-р11

карнитин-палмитоилтрансфераза 1

Миоаденилат дезаминазы дефицит, аутосомнодоминантная;

миопатия напряжения,

102770

AMPD1

1р21-р13

АМФ-дезаминаза-1, мышечная

Миопатия, обусловленная PGAM М-дефицитом, аутосомно-рецессивная,

261670

PGAMM, PGAM2

7р13-р12.3

фосфоглицератмутаза,

мышечная М

Значительная часть генов, связанных с наследственными болезнями мышщ, кодирует белки, ассоциированные с мембранами мышечных волокон. Одной из основных функций подобных белков является стабилизация мембраны за счет связывания цитоскелета мышечной клетки с внеклеточным матриксом. Это, в первую очередь, относится к стержневидному белку дистрофину, дефектному при миодистофиях Дюшенна и Беккера, получивших общее название дистрофинопатий. Дистрофии — полифункциональный белок, принадлежащий к спектрин/ос-актининовому суперсемейству белков цитоскелета. Он участвует в поддержании целостности мембраны мышечного волокна при его сокращении и в формировании нейромышечного синапса. Дистрофин является якорным белком для актиновых филамент, обеспечивающих жесткость цитоскелета миотубул. Располагается дистрофин под сарколеммой мышечного волокна. Его связь с экстраклеточными белками осуществляется через комплекс трансмембранных дистрофин-ассоциированных белков. При миодистрофии Дюшенна/Беккера, так же как при аутосомно-рецессивных дюшенно-подобных и при некоторых формах конечностно-поясных миодистрофий происходит разрушение

24

 

дистрофин-ассоциированного комплекса белков, причем в последних двух случаях первичным биохимическим дефектом часто оказывается один из белков дистрофин-ассоциированного саркогликанового субкомплекса: у-, а-, р- или 8-саркогликан. Подобные миодистрофии объединяют в группу саркогликанопатий.

Следует подчеркнуть, что разрушение дистрофинового комплекса является одним из центральных звеньев в этиологии дилатационных кардиомиопатий. При этом наследственные формы подобных заболеваний могут быть связаны с определенными дефектами как в гене дистрофина, так и в других генах, кодирующих белки дистрофин-ассоциированного комплекса, такие как а-дистрогликан, а- и у-саркогликаны (Towbin, 1998). Не исключено, что и приобретенные формы дилатационной кардиомиопатий, индуцированные энтеровирусами, в определенной степени обусловлены нарушением нормальной работы дистрофина и ассоциированного с ним комплекса белков (Badorf et al., 1999). Все эти факты свиде­

тельствуют о центральной роли дистрофин-ассоциированного комплекса белков в функционировании миоцитов и кардиомиоцитов.

Еще одна тяжелая форма миодистрофии плечевого и тазового пояса обусловлена дефектом другого белка, ассоциированного с дистрофином и также локализованного в сарколемме мышечных волокон — кавеолина-3. Мутации в гене CAV3 нарушают образование кавеол в плазматической мембране мышечных клеток. Неожиданным оказалось обнаружение не структурного, а энзиматического дефекта в специфической мышечной протеазе — кальпаине-3 — при более мягкой форме данной миодистрофии. Наиболее простым объяснением может быть возможность участия этой протеазы в деградации или дестабилизации структурных компонентов цитоскелета, экстраклеточного матрикса или Дистрофинового комплекса. Не исключается также вероятная роль этого белка в слиянии миобластов и в контроле генной экспрессии. При другой мягкой форме конечностно-поясной миодистрофии дефектным оказывается дисферлин — цитоплазматический белок с неизвестной функцией, способный взаимодействовать с ядерной мембраной и с мембранами сарко- и эндоплазматического ретикулума. Нарушение работы плектина — большого структурного якорного белка, соединяющего в кератиноцитах и в скелетных мышцах цитоскелет клетки с мембраной, приводит к необычной форме миодистрофии, сочетающейся с буллёзным эпидермолизом.

В предлагаемом руководстве в отдельную группу заболеваний выделены миопатии, обусловленные дефектами белков, ассоциированных с ядерной ламиной. Эмерин — белок, ассоциированный с ламинином ядерной мембраны, оказывается дефектным при Х-сцепленной форме мышечной дистрофии с контрактурами ЭмериДрейфуса. Более редкая аутосомно-доминантная форма этого заболевания связана с дефектом в гене LMNA, кодирующим два белка ядерной ламины — ламин А и С. Эти белки являются продуктами альтернативного сплайсинга гена LMNA и они активно взаимодействуют с эмерином.Не исключено, что аутосомно-доминантная форма мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса является аллельным вариантом одной из доминантных форм конечностно-поясной миодистрофии, ген которой LGMD1B картирован в той же области 1q11-q23, где расположен ген LMNA. Активно обсуждается возможность участия гена

LMNB1, кодирующего еще один белок семейства ядерных ламинов — В1, в контроле другой аутосомно-доминантной формы конечностно-поясной миодистрофии — LGMD1A, так как оба мутантных гена расположены в одной и той же области 5q23.3-q31.3. Миопатии, обусловленные дефектами белков ядерной ламины, иногда объединяют в группу эмеринопатий.

В самостоятельную клиническую группу выделяют врожденные непрогрессирующие миопатии, при которых дефектными, как правило, оказываются гены, экспрессирующиеся в раннем эмбриогенезе и кодирующие белки, участвующие в процессах роста, дифференцировки и пролиферации миобластов. Две из них обусловлены дефектами белков базальной ламины. Так, в основе развития врожденной миопатии, сочетающейся с гипомиелинизацией белого вещества мозга, лежит дефект мышечного белка ламинина 2, связанного с субсаркомерным цитоскелетом посредством олигомерного комплекса дистрофин-ассоциированных белков. Еще одна редкая форма врожденных миопатии связана с недостаточностью рецептора ламинина в мышцах.

Патологические процессы при некоторых врожденных миопатиях сопровождаются накоплением в клетках нерастворимых включений. Так, при немалиновой миопатии в мышечных клетках пациентов присутствуют нитеобразные патологические фибриллярные структуры, причиной образования которых является латеральная экспансия Zдисков. Эти экспансии могут возникать вследствие дефектов различных белковых компонентов тонких и толстых нитей саркомера скелетных мышц. Одна из доминантных форм заболевания связана с мутациями в гене тропомиозина В. Наиболее частая аутосомно-рецессивная медленно прогрессирующая немалиновая миопатия обусловлена мутациями в гене гигантского интегрального белка саркомера — небулина. При наиболее тяжелых доминантных формах заболевания, часто заканчивающихся летальным исходом в младенческом возрасте, дефектным оказывается ген мышечного ос-актина.

Определенные гистологические аномалии в мышечных клетках характерны также для пациентов с болезнью Центрального стержня и с миотубулярной миопатией. В обоих случаях дефектными оказываются белки, участвующие в контроле дифференцировки мышечных волокон. Мембранным мышечным белком является рецептор рианодина 1, нарушение работы которого приводит к развитию болезни центрального стержня/злокачественной гипертермии. Рецептор рианодина функционирует как кальцийвысвобождающий канал саркоплазматического ретикулу. ма скелетных мышц. Он необходим для нормального раз* вития и созревания мышц, а также его функции связаны с сокращением-расслаблением миофибрилл. Первичным биохимическим дефектом при миотубулярной миопатии, также сопровождающейся нарушениями нормального процесса созревания мышц, является миотубулярин — один из новых членов семейства тирозинфосфатаз, участвующих в регуляции роста, пролиферации и дифференцировки клеток. Различные варианты миопатии Бетлема обусловлены дефектной структурой микрофибриллярного коллагена VI типа, выполняющего в эндомизии и перимизии скелетных мышц роль моста между клетками и внеклеточным матриксом. Предполагается, что дефекты коллагена

типа VI могут оказывать влияние на процессы дифференцировки миобластов либо, что более вероятно, на струк­

турную организацию внеклеточного матрикса.

При целом ряде миопатии причиной дистрофических процессов является накопление в цитоплазме и/или в ядрах мышечных клеток гистологически идентифицируемых включений, молекулярные механизмы формирования которых могут быть совершенно различными. Так при окулофарингеальной миопатии тубулофиламентные включения образуются за счет небольшого увеличения полиаланиновой цепочки в поли(А)-связывающем белке 2, присутствующем в клетках главным образом в димерной или в олигомерной формах. Показано, что полиаланиновые олигомеры чрезвычайно устойчивы к химической денатурации и энзиматической деградации. Возможно, олигомеры поли(А)связывающего белка 2, составленные из достаточного числа мутантных молекул, могут накапливаться в ядрах в качестве филаментных включений и вызывать гибель клеток. Подобная агрегация мутантных белков с удлиненными полиглютаминовыми треками обнаружена в ядрах нейронов по крайней мере при четырех нейро-дегенеративных заболеваниях, обусловленных экспансией CAG-повтора: при хорее Гентингтона, двух формах спиноцеребеллярной атаксии и при денторубральной паллидо-люисовой атрофии (данные нозологические формы будут рассмотрены во второй части монографии).

Накопление в саркоплазме сердечной и скелетных мышц плотных гранулофиламентных агрегатов, содержащих

десмин, является причиной развития аутосомно-доминантной миопатии, дебютирующей во взрослом возрасте слабостью проксимальных и дистальных мышц конечностей в сочетании с кардиомиопатией и катарактой. Десмин принадлежит семейству промежуточных филамент типа III, участвующих в поддержании структурной целостности мышц. Образование патологических десмин-содержащих агрегатов может быть следствием аномалий в самом десмине или во взаимодействующем с ним белке — аВ-кристаллине. Это мажорный белок хрусталика, присутствующий также в сердечной и в скелетных мышцах. Описаны и другие формы миопатии с филаментными включениями в мышечных волокнах. Однако мо­

лекулярная природа образования этих включений остается пока неизвестной.

Мутации мтДНК, в том числе делеции и дупликации, приводящие к дефициту одного или нескольких ферментов в митохондриальной респираторной цепи, а также мутации в генах тРНК ответственны за наследственные заболевания, получившие название митохондриальных энцефаломиопатий. Мышечная слабость часто выступает в качестве одного из ведущих симптомов при этих болезнях, которые, как прави­

ло, носят мультисистемный характер. Митохондриальные энцефаломиопатий не обязательно обусловлены дефектами в мтДНК, а могут быть связаны как с доминантными, так и с рецессивными мутациями в аутосомных генах.

И наконец, недостаточность активности ряда мышечных ферментов служит причиной развития относительно доброкачественных метаболических миопатии.

Остановимся более подробно на каждом из перечисленных выше заболеваний.

1.2. Миодистрофия Дюшенна/Беккера и дюшенно-подобные

аутосомно-рецессивные миопатии

Миодистрофия Дюшенна и аллельный ей вариант миодистрофии Беккера — наиболее частая и хорошо изученная форма тяжелой нервно-мышечной патологии. Ген, ответственный за эти два заболевания, был открыт методами обратной генетики около 15 лет тому назад. Это открытие сопровождалось не только идентификацией белка, дефектного при миодистрофии Дюшенна/Беккера и получившего название дистрофин, но и выявлением целой серии его укороченных изоформ — апо-дистрофинов, способных выполнять в раз­

личных типах клеток спецализированные функции, отличные от функций дистрофина. Вслед за открытием дистрофина было описано более десятка других до этого неизвестных белков, тесно связанных с дистрофином и образующих так называемый дистрофин-ассоциированный комплекс. Оказалось, что основной причиной развития патологических процессов при

дюшенно-подобных миопатиях является разрушение трансмембранного дистрофин-ассоциированного комплекса белков. Подобная деструкция может происходить вследствие генетических дефектов либо в самом дистрофине, как это наблюдается у больных с миодистрофией Дюшенна/Беккера,

либо в других белках дистрофин-ассоциированного комплекса и это в свою очередь может явиться причиной развития гораздо более редких аутосомно-рецессивных дюшенно-подобных миопатии. Однако мутации в генах, кодирующих белки дистрофин-ассоциированного комплекса, сопровождающиеся, как правило, частичным или полным его разрушением, не всегда реализуются в форме таких миопатии, а часто могут приводить к различным вариантам конечностно-поясных и некоторых других мышечных дистрофий, о чем речь пой­

дет ниже. В большинстве случаев точная диагностика аутосомно-рецессивных дюшенно-подобных миопатии возможна только на базе молекулярно-генетического анализа.

Не исключено, что разрушение дистрофин-ассоциированного комплекса белков может происходить не только в оезультате генетических дефектов, но и вследствие вирусных инфекций. Это, в частности, доказано в отношении вируса Коксаки, способного разрушать дистрофии и ассоциированный с ним комплекс белков в кардиомиоцитах, и это, повидимому, является одним из начальных молекулярных механизмов патогенеза наиболее частой приобретенной формы дилатационной кардиомиопатий.

Учитывая особую значимость миодистрофии Дюшенна и дистрофинопатий среди нервно-мышечных заболеваний, мы постарались дать наиболее полный обзор молекулярногенетических исследований, проводимых в последние годы в этой области неврологии. На примере дюшенно-подобных миодистрофии особенно отчетливо может быть прослежена связь между открытием гена и расшифровкой молекулярных основ патогенеза, а значит, и разработкой методов точной диагностики (включая пренатальную), профилактики и терапии моногенных заболеваний.

а) Псевдогипертрофическая мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера (MIM: 310200)

1. Клиническая характеристика заболевания

Х-сцепленная рецессивная псевдогипертрофическая мышечная дистрофия Дюшенна, впервые подробно описанная G.Duchenne в 1868 г., — одна из наиболее частых и злокачественных форм нервно-мышечной патологии детского возраста, характеризующаяся началом клинических прояв­

лений в первом пятилетии жизни, прогредиентным течением заболевания с последующей инвалидизацией и летальным исходом, как правило, в конце второго — начале третьего Десятилетия жизни. Обобщенные данные о распространенн °сти миодистрофии Дюшенна в разных популяциях указывают на относительно высокую частоту этой формы, колеблющуюся от 9,7 до 32,6 случаев на 100 000 родившихся жив ь , ми мальчиков. Для Санкт-Петербурга она составляет не менее 18,9 на 100 ООО (Красильников, 1989). Примерно 1/з единичных случаев миодистрофии Дюшенна должна быть обусловлена вновь возникшими мутациями (при условии равенства частоты мутирования в мужских и женских гаметах, а также нулевой фертильности больных). Последнее обстоятельство имеет принципиальное значение для оценки повторного риска при медико-генетическом консультировании соответствующих семей. Долгое время в литературе обсуждался вопрос о взамоотношении миодистрофии Дюшенна и мышечной дистрофии Беккера (Беккера-Кинера), впервые описанной в 1955 г. (Becker, Kiener, 1955), протекающей со сходной клинической картиной, но отличающейся относительно доброкачественным течением. К настоящему времени получены данные, однозначно указывающие на то, что обе формы являются результатом мутаций в одном и том же локусе. Так называемые женские случаи миодистрофии Дюшенна/Беккера возможны у девочек с Х-аутосомной транслокацией либо числовой аномалией Х-хромосомы (моносомия X). Сходные с миодистрофией Дюшенна клинические проявления могут отмечаться у лиц женского пола с дюшенно-по-

добными аутосомно-рецессивными формами миопатии (см. ниже). В части случаев субклинические проявления миодистрофии Дюшенна/Беккера в виде «малой болезни» отмечаются у гетерозиготных носительниц мутантного гена. На наличие «малых признаков» у женских родственников больных миодистрофией Дюшенна указывал еще С. Н. Давиденков (Давиденков, 1934). Клиническая симптоматика носительства может проявляться умеренным снижением мышечной силы и сухожильных рефлексов, утолщением (за счет псевдогипертрофии) икроножных мышц, поясничным гиперлордозом, варусной деформацией стоп, другими симптомами. Данное обстоятельство хорошо объясняется гипо­

тезой Лайон, предполагающей случайную инактивацию одной из Х-хромосом в женском зачатке в раннем эмбриогенезе и соответственно преобладанием в подобных случаях среди функционально активных Х-хромосом, несущих м утантный аллель.

Клиническая картина миодистрофии Дюшенна достаточно хорошо изучена (Дрознина, 1970; Гринио, 1976). Заболевание характеризуется сравнительно ранним началом и относительно быстрым прогрессированием процесса. Первые признаки заболевания в виде мышечной слабости появляются в возрасте 2—5 лет. У части детей отмечается задержка темпов моторного развития уже на 1—2-м году жизни. Дети начинают испытывать затруднения при ходьбе по лестнице, вставании с пола, перестают бегать. Очень типичной становится переваливающаяся («утиная») походка, заключающаяся в раскачивании в тазобедренных суставах. Рано возникают псевдогипертрофии за счет разрастания жировой и соединительной ткани, захватывающие главным образом икроножные, дельтовидные и ягодичные мышцы. В последующем постепенно появляются гипотрофии мышц бедер и тазового пояса, нередко внешне скрытые из-за развитой подкожной жировой клетчатки. Процесс носит отчетливо восходящий характер: мышечная слабость и гипотрофии распространяются на мышцы спины, плечевого пояса, проксимальных отделов верхних конечностей. Характерны «крыловидные лопатки», симптом «свободных надплечий». Из-за усиливающейся слабости к 9—12 годам дети, как правило, перестают ходить, постепенно превращаясь в «кресельных пациентов». Становятся заметными вторичные деформации скелета, усиливаются атрофии и сухожильные ретракции. Наиболее ранние изменения обнаруживаются в ахилловых сухожилиях, приводящие в последующем к патологической деформации стоп. Возможны контрактуры в локтевых, коленных и тазобедренных оуставах. Первым из глубоких рефлексов исчезает коленный, затем—рефлексы с двуглавой и трехглавой мышц. Дольше других сохраняется ахиллов рефлекс. Для миодистрофии Дюшенна типично поражение сердечной мышцы в виде кардиомиопа^ и . При ЭКГ-исследовании обнаруживаются углубление зубца

П а т ология зубца R, блокада ножки пучка Гиса. Особенностью данной формы миопатии является нередко наблюдаемая

Заказ № ПО

умственная отсталость, как правило, неглубокая. Причиной летального исхода являются обычно пневмонии, которые больные не в силах перенести из-за включения в процесс дыхательной мускулатуры. Лабораторная диагностика миодистрофии Дюшенна/Беккера включает использование различных методов: электрофизиологических, биохимических, гистологических, а в последние годы — гистохимических и молекулярно-генетических. Электромиографическое исследование, а также изучение мышечных биоптатов обнаруживает признаки первично-мышечного поражения. Удобным и информативным тестом является определение сывороточной креатинкиназы, уровень активности которой в случае миодистрофии Дюшенна в десятки раз превышает нормальные значения. Следует подчеркнуть, что данный тест может быть использован в до- или субклинической ста­

дии заболевания.

2. Картирование и идентификация гена DMD

Ген миодистрофии Дюшенна — DMD (Duchenne muscular dystrophy) — один из первых генов человека, идентифицированных методами позиционного клонирования. Успешному клонированию гена предшествовало описание достаточно редких пациентов, имеющих в области локализации гена цитогенетически идентифицируемые структурные перестройки — транслокации и делеции. Так, в частности, у нескольких девочек, страдающих заболеванием, сходным по клинике с миодистрофией Дюшенна, были обнаружены различные реципрокные Х-аутосомные транслокации, причем во всех случаях точка разрыва Х-хромосомы оказалась локализована в области р21 (Burghes et al., 1987; Boyd et al., 1988; Bodrug et al., 1989). Было высказано предположение, нашедшее подтверждение в последующих исследованиях, что клиника миодистрофии Дюшенна у этих девочек развивается вследствие разрушения транслоцированного гомолога DMD-гена, локализованного в области Хр21, в сочетании со специфическим характером лайонизации нормальной Х-хромосомы. На следующем этапе изолированные последовательности ДНК, примыкающие к точкам разрывов Х-хро-

 

мосомы при транслокациях или отсутствующие у пациентов с делециями, были использованы в качестве зондов для поиска и анализа полиморфных сайтов рестрикции, сцепленных с геном миодистрофии Дюшенна. Одним из первых таких зондов была последовательность RC8, локализованная методами соматической гибридизации в области Хр22.3-р21 на расстоянии около 10сМ от DMD-гена (Murrey et al., 1982). В дальнейшем была изолирована целая серия подобных последовательностей ДНК. Среди них фрагмент гена орнитинтранскарбомилазы (ОТС), зонды р754, XJ1-8, а также внутригенные зонды серии pERT (Francke et al., 1985; Bakker et al., 1985; Kunkel et al., 1985). С помощью этих ДНК-зондов было обнаружено большое число полиморфных сайтов рестрикции, ассоциированных с DMD-reном, и определены генетические расстояния между ними. В

табл. 3 показано расположение некоторых полиморфных маркеров относительно DMD-гена и суммированы результаты нескольких исследовательских групп по оценке частот рекомбинации между этими локусами (Murray et al., 1982; Boyd et al., 1988; Chen et al., 1989; Abbs et al., 1990).

Таблица 3 Расположение полиморфных сайтов рестрикции, сцепленных с геном дистрофина

Локус

ДНК-зонд

Границы гена

Расстояния в сМ

DXS84

р754

DXS206

рХЛ-8

DYS MSA *)

3.7 + 0.6

DXS142

PERT84

5′ DMD

1.0 +0.4

DXS164

PERT87

МР1Р *)

DXS41

р99-6

3′ DMD

1.9+ 0.6

DXS270

J-Bir

DXS28

12.0 + 1.1

*) микросателлитные маркеры, фланкирующие ген дистрофина.

Описание большого количества полиморфных маркеров, сцепленных с DMD-геном, и точное физическое картирование области его локализации способствовало изоляции специфической мРНК из скелетных мышц плода, клонированию и секвенированию полноразмерной кДНК длиной в

14 тысяч пар нуклеотидных оснований (Koenig et al., 1987; Monaco, Kunkel, 1988). DMD — самый крупный из известных в настоящее время генов, его размер 2.5 миллиона пар оснований, и он занимает около 2% Х-хромосомы. Кодирующая часть гена DMD разделена на 79 экзонов и составляет менее 1% геномной области (Roberts et al., 1992с; 1993).

3. Мутации в гене DMD и их диагностика

Более чем в 60% случаев у больных мальчиков с миодистрофией Дюшенна/Беккера обнаруживаются протяженные делеции в гене DMD, захватывающие от одного до нескольких соседних экзонов и сосредоточенные обычно в двух «горячих» районах — в области 5′-конца гена (экзоны 6—19) и в З’-конце (экзоны 40—53), при этом 30% делеций локализованы в проксимальной части гена и 70% — в дистальной

(Koenig et al., 1989; Dunnen et al., 1989; Liechti-Gallati et al., 1989; Oudet et al., 1992). Считается, что в 30% семей с единичными случаями миодистрофии Дюшенна/Беккера болезнь развивается вследствие спонтанного возникновения в гаметах мутаций в DMD-гене и матери таких больных не являются гетерозиготными носителями этих мутаций. В подобных семьях риск повторного рождения больного ребенка минимален и не превышает общепопуляционной частоты. В остальных 70% семей матери больных мальчиков гетерозиготны по мутациям DMD-гена, и при каждой беременности таких женщин риск повторного рождения больного сына составляет 50%. Очень часто концы делеций локализованы в центральной части гена DMD. Так, в интроне 44, протяженностью 160—180 кб, расположено около 40% точек разрыва всех делеций. Проксимальные делеции возникают, по-видимому, в раннем эмбриогенезе и имеют больше шансов стать «семейными» мутациями. Дистальные делеции возникают позднее и чаще встречаются как изолированные случаи. Считается, что повторный риск рождения больного ребенка с проксимальной вновь возникшей делецией составляет 30%, тогда как с дистальной — только 4% (Passos-Bueno et al., 1992).

По-видимому, значительная часть делеций в гене DMD возникает при мейотической рекомбинации. Частота мейо-

тической рекомбинации в гене дистрофина составляет 10%, что в 4 раза больше, чем можно было ожидать на основании

длины гена (Qudet et al., 1992). С использованием 10 внутригенных полиморфных маркеров показано существование двух горячих точек рекомбинации в гене DMD. Одна из них между экзонами 44 и 51 с пиком в 44-м интроне, другая между нитроном 7 и 5′-концом DMD. Локализация горячих точек рекомбинации очень сходна с распределением точек разрывов делеций у пациентов с миодистрофией Дюшенна/Беккера. Эти результаты дают основание предполагать участие одного и

того же молекулярного механизма, лежащего в основе образования делеций и повышения частоты рекомбинации в гене DMD.

В нескольких случаях показано, что один из концов делеций, локализованных в интроне 43, расположен внутри ТНЕ1 элемента, принадлежащего семейству ретротранспозонов (Pizzuti et al., 1992). Эти элементы, размером 2.3 кб, фланкированные 350-нуклеотидными длинными терминальными повторами (LTR), встречаются в геноме человека около 10 ООО раз. Гипотеза о том, что нестабильность гена DMD вызвана присутствием транспозоно-подобного элемента, привлекается также для объяснения нескольких случаев обнаружения различий в молекулярном дефекте у пациентов, принадлежащих одной и той же родословной, у которых предпо­

ложительно должна быть мутация общего происхождения (Miciak et al., 1992). В некоторых случаях удалось проследить присутствие Alu-элементов, локализованных в точках разрывов внутригенных структурных перестроек. Так, при секвестровании концевых участков дупликаций в гене DMD в 2 случаях из 8 были обнаружены Alu-элементы (Ни et al., 1989). В остальных 6 случаях рекомбинация осуществлялась между негомологичными последовательностями.

Делеции в гене DMD часто возникают в процессе пролиферации зародышевых клеток, следствием чего является гонадный мозаицизм — появление нескольких генераций половых клеток (ооцитов) с мутантными и нормальными аллелями (Darras et al., 1988; Bakker et al., 1989). Гонадный мозаицизм представляет серьезную проблему для диагностики гетерозиготного носительства и, следовательно, для медикогенетического консультирования семей с миодистрофией Дюшенна. Предполагается, что такие мутации могут возникать еще на уровне первичных половых клеток, то есть на ранних стадиях внутриутробного развития будущей матери. По ориентировочным оценкам примерно 6—7% всех спорадических случаев являются следствием гонадного мозаицизма у матери. Оценить величину аберрантного клона ооцитов практически не представляется возможным. В связи с этим прогноз в отношении здоровья следующего ребенка в семьях, в которых у матери больного миодистрофией Дюшенна не удается определить гетерозиготное носительство, весьма затруднен. Эмпирически определено, что при наличии спорадического случая рождения ребенка с миодистрофией Дюшенна и при отсутствии прямых молекулярных доказательств гетерозиготного носительства мутации в гене дистрофина у матери риск повторного рождения больного ребенка может достигать 14% (Essen et al., 1992). Мутации возникают преимущественно в оогенезе (Bakker et al., 1989), несмотря на то, что теоретическая вероятность отцовского происхож­

дения делеций в гене дистрофина выше за счет большего числа репликаций ДНК, происходящих в процессе созревания мужских половых клеток (Giannelli, 1988).

Отмечены особенности паттерна делеций в разных европейских популяциях (Beggs et al., 1990; Abbs et al., 1991) и в популяциях России и стран СНГ (Baranov etal., 1993). Так, в результате объединенных межлабораторных исследований показано, что соотношение делеций в 3′- и в 5′-районах «гооячих» точек возникновение мутаций в различных популяциях Западной Европы составляет 3.5:1, тогда как в России только 2:1. У некоторых пациентов может быть делетирован не только весь ген дистрофина, но достаточно протяженные соседние области. Прямой корреляции между тяжестью течения заболевания и длиной делеций не отмечается, но раз­

личия между формами Дюшенна и Беккера в общем случае связаны с наличием или отсутствием сдвига рамки считывания (Malhotra et al., 1988; Koenig et al., 1989). При миодистрофии Дюшенна делеций сопровождаются сдвигом рамки считывания и вследствие этого преждевременной терминацией трансляции, тогда как при форме Беккера такого сдвига не происходит. Поэтому у пациентов с миопатией Дюшенна продукт гена либо полностью отсутствует, либо деградирует вскоре после синтеза. У больных с формой Беккера такой белок, как правило, присутствует, хотя и в измененном, чаще всего в укороченном виде. Эта гипотеза оказалась справедливой

для 94% делеций с картированными точками разрывов. Исключения из этого правила связаны со сложным характером экспрессии гена DMD.

Рис. 1. Расположение кДНКовых зондов гена дистрофина

После клонирования гена появилась возможность использовать кДНКовые зонды для анализа изменчивости внутРигенных полиморфных сайтов рестрикции. На рис. 1 показано расположение этих зондов относительно кДНК-гена дистРофина. кДНКовые зонды явились прекрасными маркерами для выявления делеций в DMD-гене (Dunnen et al., 1989).

табл. 4 указаны некоторые полиморфные сайты рестрик-

Чии» выявляемые с помощью этих кДНК-овых зондов. Распо-

 

ложение относительно гена DMD геномных районов, гибридизующихся с некоторыми геномными и кДНКовыми зондами, после рестрикции ДНК редкощепящей эндонуклеазой Sfj I изображено на рис. 2.

Рис. 2. Расположение относительно гена дистрофина геномных районов, гибридизирующихся с некоторыми

геномными и кДНКовыми зондами,     после рестрикции ДНК редкощепящей эндонуклеазой Sfi       1

Таблица 4

кДНКовые полиморфные сайты рестрикции

Районы кДНК

Рестриктаза

Аллели (кб)

мажорная

минорная

0-2а

Xmn1

2.0

2.1

ЗЬ-5а

EcoR1

9.4

9.7

5Ь-7

EcoRY

7.3

10

EcoR1

10.5

13

Xmn1

4.7

4.4

9 -10

EcoRY

12

14

Pvu11

9.3

11

Taq1

2.1

1.7

разработаны очень эффективные методы диагностики

делеций в гене DMD, основанные на мультиплексной (множественной) полимеразной цепной реакции (Chamberlain et al., 1988а; 1990; Beggs et al., 1989; 1990;. Abbs et al., 1991). Одновременная амплификация 18 экзонов и промоторной части гена позволяет выявить до 98% всех протяженных делеций гена (рис. 3). На этом рисунке у пациентов под номерами 1—5 делетированы соответственно экзоны 51-60, 4244,47-52,43-60 и 13-19. Идентификация делеций в гене DMD у больного является бесспорным подтверждением диагноза миодистрофии Дюшенна/Беккера. Кроме того, в семьях с генотипированной делецией возможна прямая пренатальная

диагностика заболевания, которая обычно проводится в первом триместре беременности. В некоторых случаях делеций в DMD находят у пациентов, клинически отнесенных к другим формам миопатии: аутосомно-рецессивной миодистрофии Фукуяма (Arahata et al., 1989; Francke et al., 1989), спинальной амиотрофии (Clarke et al., 1989), тазовопоясной миодистрофии Лейдена-Мебиуса (Arikawa et al., 1991). Во всех этих случаях проводится корректировка диагноза в пользу миодистрофии Дюшенна/Беккера.

                              ГЧ                    I                        с                    о                      м                                             14                        О                         Э

Ри

с 3. Идентификация делеций в гене дистрофина методом множественной полимеразной цепной реакции

Однако для обнаружения гетерозиготного носительства делеции у матери больного ребенка метод мультиплексной ПЦр не может быть использован. В ряде случаев носительство делеции удается установить по появлению фрагментов ДНК необычного размера (junction fragments) при проведении блот гибридизации рестрицированной геномной ДНК с внутригенными кДНКзондами. Однако такие фрагменты обнаруживаются не более чем в 17% случаев делеций в гене DMD. Для выявления гетерозиготного носительства делеций, дупликаций или инсерций в гене DMD в общем случае был разработан метод обратной ПЦР (RT PCR), основанный на изоляции специфической мРНК, обратной транскрипции и использования образовавшейся кДНК в качестве матрицы для проведения мультиплексной амплификации всей кодирующей области гена (Roberts et al., 1990). После электрофоретического разделения продуктов амплификации фрагменты ДНК необычного размера образуются при любых структурных внутригенных перестройках, находящихся как в гемизиготном, так и в гетерозиготном состоянии. Таким образом, обратная ПЦР является наиболее эффективным методом молекулярной диагностики делеций не только у пациентов с миодистрофией Дюшенна/Беккера, но и у их родственников.

Ген миодистрофии Дюшенна может быть вовлечен также в другие структурные перестройки (Ни et al., 1989). Так, у 5% пациентов наблюдаются дупликации одного или нескольких экзонов. В относительно небольшом проценте случаев у больных обнаружены микроделеции, захватывающие от 1 до нескольких нуклеотидов, а также много нонсенс-мутаций, повидимому, из-за присутствия в гене DMD большого количества глютаминовых триплетов, мутации в которых часто приводят к образованию стоп-кодонов. Крайне редки миссенсмутации (Roberts et al., 1992а; 1992b).

Молекулярная диагностика мутаций неделеционного типа чаще всего осуществляется косвенными методами. В начальный период исследований для этих целей использовали внутригенные полиморфные сайты рестрикции (табл. 3 и 4). В дальнейшем в гене миодистрофии Дюшенна были обнаружены мно^численные микросателлитные гипервариабельные последоаательности, отличающиеся очень высоким уровнем информативности (Beggs, Kunkel, 1991; Feener et al., 1991). В табл. 5 представлена характеристика полиморфных микросателлитных повторов, локализованных в гене DMD. Наиболее удобными для пренатальной диагностики миодистрофии Дюшенна являются аллельные варианты динуклеотидных СА повторов в интронах 49 и 50 — STR-49; STR-50 (Chen et al., 1989; Abbs et al., 1990; 1991;Beggs etal., 1989; 1990; 1991; Clemens etal., 1991;Oudet etal., 1991; Евграфов, Макаров, 1991).

Таблица 5 Микросателлитные полиморфные маркеры            гена дистрофина

Маркер

Повтор

Локализация

Уровень гетерозиготности

(PIC)

DYSI

DYSII

DYSIII

DYSIV

(ТА)11(СА)6

(СА)23

(ТА)11(СА)10

TACA(TG)5(TA)4TG

5′-нетранслируемая область

0.586 — 0.786

DYSMSB

(TG)29

5′-нетранслируемая область

0.25

DYSMSA

(TG)21

интрон 1

0.57

DMD-44

(CA)n

интрон 44

>0.8

DMD-45

(CA)n

интрон 45

>0.8

UMD-49

(CA)n

интрон 49

>0.8

(CA)n

интрон 50

>0.8

(CA)n

З’-нетранслируемая область

0.35

(CA)8TA(CA)7

З’-нетранслируемая область

0.46

(TTGA)n

З’-нетранслируемая область

0.17

Для всех представленных в табл. 5 вариабельных по* второв разработана простая и эффективная система их ге* нотипирования с помощью ПЦР, то есть для всех этих сайтов подобраны системы праймеров из уникальных смежных об*

ластей ДНК. Для того чтобы избежать ошибок косвенной диагностики, связанных с возможностью внутригенной рекомбинации, необходимо использовать несколько полиморфных маркеров, фланкирующих ген DMD.

4. Структура и функции дистрофина

Основным продуктом гена DMD в мышцах является структурный белок с молекулярной массой в 427 кД — дистрофин, имеющий стержневидную форму с длиной около 125 нм. Это полифункциональный белок, участвующий в формировании нейромышечного синапса и в поддержании целостности мембраны мышечного волокна при его сокращении (Sealock, Froehner, 1994).

Дистрофин относится к числу минорных белков, его содержание по отношению к общему белку мышц составляет всего 0.002% и поднимается до 5% среди мембранных белков цитоскелета. В мышцах дистрофин локализован на цитоплазматической поверхности сарколеммы. В нейромышечных соединениях он является компонентом постсинаптической мембраны и участвует в синаптогенезе. В мышечно-сухожильных соединениях дистрофин ко-локализован с талином, винкулином и утрофином — продуктом аутосомного гомолога гена DMD (см. ниже).Мышечно-сухожильные соединения являются основным сайтом силовой трансмиссии. Это

также место локализации контакта между актиновым цитоскелетом и внеклеточным матриксом, при этом дистрофин и утрофин концентрируются именно в точках данных специализированных контактов.

Дистрофин принадлежит к спектрин/ос-актининовому суперсемейству белков цитоскелета (Koenig et al., 1988). Он состоит из 4 отдельных доменов (рис. 4), обнаруживающих много общих черт со спектрином и ос-актинином. Так,

 

isl-концввой домен дистрофина имеет сходство с большим семейством актинсвязывающих белков, и в частности — с isi-концевыми доменами а-актинина и р-спектрина. Во всех типах клеток эти белки выполняют структурную роль при физиологических, статических и динамических клеточных процессах. Наиболее крупный домен, обеспечивающий гибкость молекулы, имеет структуру трехгранного стержня. Он образован 24 слегка повторяющимися сегментами, каждый из которых содержит около 110 аминокислотных остатков, а-актинин содержит четыре подобных повтора, а спектрины — 17 или более. Следующий за стержневым участком цистеин-богатый домен, состоящий из 150 аминокислот, сходен с СООН-фрагментом А-актинина и содержит два неполных Са2+-связывающих мотива. Для последнего 420-аминокислотного С-концевого домена не найдено гомологии с другими белками. Последовательности цистеин-богатого и С-концевого доменов дистрофина высококонсервативны, что указывает на их особую функциональную значимость. В С-концевом домене обнаружены многочисленные потенциальные сайты фосфорилирования, в том числе для МАР-киназы, p34cdc2-, СаМ- и казеиновой киназы. Это предполагает возможность участия дистрофина в трансдукции сигналов через сарколемму мы­

шечного волокна (Michalak et al., 1996).

Рис. 4. Модель молекулы дистрофина

После расшифровки аминокислотной последовательнос т и белка была предложена схема его функционирования, согласно которой дистрофин в цитоплазме клетки распоп^ гается под сарколеммой мышечного волокна в виде перепле*

тенного антипараллельного димера (рис. 5). N-конец дистро. фина связан с цитоплазматическим актином, причем имеет большее сродство (аффинитет) не с саркомерным, а с немы* шечным F-актином. Таким образом, дистрофин не связан напрямую с сократительным аппаратом мышечного волокна, а соединен с субмембранной сетью цитоплазмы, образованной немышечным актином (Ervasti, Campbell 1991; Monaco, 1989). Точнее, дистрофин взаимодействует с G-актиновыми мономерами и способствует G->F актиновой трансформации, которая стимулируется Са+-зависимым присутствием кальмодулина (Fabbrizio et al., 1995b). Дистрофин является якорным белком для актина и таким образом он вовлечен в контроль деформации поверхности клеточной мембраны и в развитие F-актиновой сети, обеспечивающей жесткость цитоскелета миотубул.

Рис. 5. Расположение дистрофина под сарколеммой мышечного волокна

С-конец дистрофина соединен с трансмембранным комплексом, состоящим из белков с молекулярными весами 156, 59, 50, 43, 35 и 25 кД (Ervasti, Campbell, 1991). Эти * ки получили название дистрофин-ассоциированных белков (DAP) или дистрофин-ассоциированных гликопротеинов (DAG). Дистрофин-гликопротеиновый комплекс участвует в регуляции внутримышечного уровня кальция, обеспечивая связь кальциевого комплекса с цитоскелетом клетки, и не исключено, что сам этот комплекс является кальциевым каналом. 156DAG, 50DAG, 43DAG и 35DAG содержат аспарагин-связанные олигосахариды, то есть являются гликопротеинами. 156DAG дополнительно содержит терминально сиализированные серин/треонин-связанные олигосахариды, что, по-видимому, обеспечивает его повышенную устойчивость к действию протеаз. При этом сам дистрофии и 59DAP относятся к элементам цитоскелета, 156DAG располагается на внешней стороне мембраны, в то время как остальные белки комплекса интегрированы с мембраной. У больных с миодистрофией Дюшенна/Беккера и с другими аутосомно-рецессивными дюшенно-подобными миодистрофиями, а также с некоторыми формами конечностно-поясных миодистрофии этот комплекс оказывается частично или полностью разрушенным.

Дистрофии способен взаимодействовать с рядом других белков, не входящих в описанный выше комплекс. Так, лигандом для дистрофина служит ацикулин — неэнзиматический белок, родственный фосфоглюкомутазе первого типа. В мышцах ацикулин ведет себя подобно типичному дистрофин-связанному белку, располагаясь в сарколемме. Недавно было показано, что дистрофии ассоциирован также с синтетазой окиси азота нейронального типа — nNOS (Brenman et al., 1995). В скелетных мышцах nNOS соединяется с сарколеммой через дистрофин-гликопротеиновый комплекс белков. Еще одним ассоциированным с дистроФином белком является мышечный кавеолин-3 — сарколеммный белок, являющийся главным компонентом каве0 Л плазменных мембран.

Сконструированы антитела на различные антигенные

Детерминанты дистрофина, нашедшие широкое применение для его иммунодетекции непосредственно в белковом лизате мышц и на гистологических препаратах

(Hoffman et al., 1989а; 1989b; Arahata et al., 1989). В последнем случае специфическая окраска на дистрофин располагается по периферии клеток (рис. 6). Как правило, у больных с миодистрофией Дюшенна либо вовсе не обнаруживается иммунореактивных форм белка, либо мутантный белок обнаруживается лишь при использовании определенных антисывороток, чаще всего на аминотерминальную часть белка. В мышцах гетерозигот наблюдаются локальные области отсутствия иммуноокрашивания на дистрофин. При форме Беккера биохимические аномалии дистрофина выявляются в виде прерывистого характера окрашивания мышц, что свидетельствует о дефектах в структуре цитоске­

Рис. 6. Иммуно- лета миофибрилл. Иммунологический гистохимический анализ является наиболее простым анализ дистрофина способом диагностики гетерозиготно­

в   мышечных клетках

а — норма, б — миодистрофия Дюшенна, в — гетерозиготы (стрелками показаны             зоны отсутствия дистрофина).

го носительства мутаций в гене DMD у родственниц пробанда. Однако для его осуществления необходимо проводить биопсию мышц. В настоящее время иммуногистохимические методы анализа с применением антисывороток на разные районы дистрофина активно используются не только при медико-генетическом консультировании и проведении пренатальной диагностики (Bieber et al., 1989; Ginjaar

 

etal., 1989; Bulman et al., 1991), но и при изучении молекулярных основ патогенеза миодистрофии (Hurko etal., 1989).

У некоторых пациентов с миопатией Дюшенна при иммуногистохимическом окрашивании мышц обнаруживаются редкие дистрофин-положительные волокна. При этом в случае использования антител с антигенными детерминантами, кодируемыми делетированным участком гена, окрашивания не происходит, и это позволяет отвергнуть гипо­

тезу соматического мозаицизма. Наиболее вероятный механизм такого явления — возникновение второй сома­

тической делеций в мышечной ткани, компенсирующей едвиг рамки считывания, происходящий вследствие основной делеций. В результате мутантный локус может целиком транскрибироваться и транслироваться с образованием стабильного, хотя и аномального дистрофина (Klein et al., 1992).

5. Регуляция транскрипции и сплайсинга гена DMD. аподистрофины

В соответствии с современными представлениями огромный ген DMD находится под контролем сложной системы регуляции транскрипции и сплайсинга (Ahn, Kunkel, 1993). Показано, что транскрипция DMD осуществляется со средней скоростью 2.4 кб в минуту, так что для образования полноразмерного РНК-транскрипта требуется 16 часов (Tennyson et al., 1995). Одновременно до окончания синтеза РНК, то есть ко-транскрипционно, начинается сплайсирование первичного РНК-транскрипта. При этом скорость накопления «Фанскриптов на З’-конце гена уменьшается по сравнению с бЧонцом, возможно, за счет преждевременной терминации транскрипционных комплексов.

По крайней мере, восемь независимых промоторов осуществляют альтернативную специфическую транскрипцию °MD В разных тканях и на разных стадиях эмбрионального Развития (табл. 6).

Таблица 6

Изоформы дистрофина

Изоформы дистрофина

Размер мРНК(кб)

Локализаци промотора

Экспрессия

мышечный

14

5′-UTR область

сердечная и скелетные мышцы

мозговой

14

1 интрон

кора и гиппокамп

мозговой

14

1 интрон

клетки Пуркинье

1 — Dp71

4.5-4.8

63 интрон

повсеместно, кроме мышц

2-Dp116

5.5

56 интрон

периферические нервы

3 — Dp40

2.2

повсеместно, кроме мышц

Dpi 40

7.5

44 интрон

эмбриональные нейроны

Dp260

сетчатка

Один промотор мышечного типа (М) и два мозгового, активные в кортикальном отделе мозга (С) и в клетках Пуркинье (Р) соответственно, экспрессируют полноразмерную молекулу дистрофина, в то время как пять других промоторов (среди них R, ВЗ, S, G) обеспечивают экспрессию последних доменов взаимоисключающим способом, главным образом в немышечных и в немозговых тканях. Основным продуктом DMD в сердечной и скелетных мышцах является 14-кб РНК-транскрипт. В различных отделах мозга продуцируются три полноразмерные формы дистрофина с разных промоторов, а соответствующие транскрипты различаются по первому экзону (Chamberlain et al., 1988b; Nudel et al., 1989; Boyce et al., 1991). Один из промоторов мозгового типа (С) расположен в первом интроне DWD на расстоянии более 90 кб от мышечного промотора (Celly et al., 1990; Gorecki et al.,

1992). 14-кб мРНК — продукты дистрофинового гена мышеч-

н ого и мозгового типа, различающиеся по структуре первого экзона, одновременно присутствуют в нейронах коры и гиппокампа, и дополнительный полноразмерный транскрипт идентифицирован в клетках Пуркинье. В последнем случае транскрипт также отличается от двух известных продуктов по струк­

туре первого экзона, который оказался локализован в большом интроне между мышечным промотором и вторым экзоном гена. Все образующиеся при этом формы дистрофина имеют небольшие отличия в N-концевом участке белка.

В немышечных тканях и в клеточных линиях найдено множество укороченных форм дистрофина — апо-дистрофинов, образующихся за счет альтернативной транскрипции — Dp40, Dp71, Dpi 16, Dpi40, Dp260. Цифры в названии этих белков соответствуют молекулярным весам соответствующих апо-дистрофинов. Dp71, или апо-дистрофин-1, по-видимому, является основным продуктом гена DMD в немышечных тканях, включая ткани мозга (Lederfein et al., 1993а; 1993b; Bar etal., 1990). В Dp71 присутствует С-концевой домен дистрофина и часть цистеин-богатого, а также 7 дополнительных аминокислот на N-конце белка. Содержание этого белка в некоторых тканях сопоставимо с количеством дистрофина в мышцах, и особенно обильно он представлен в клетках Шванна, где дистрофии отсутствует (Blake et al., 1992). В скелетных мышцах взрослых Dp71 отсутствует, тогда как в мышцах плода наряду с дистрофином экспрессируется и апо-дистрофин-1. Уровень мРНК Dp71 в культуре дифференцирующихся миобластов сохраняется стабильным, тогда как содержание белка в процессе дифференцировки значительно возрастает, что указывает либо на его большую стабильность по сравнению с полноразмерным дистрофином, либо на возможность изменений в эффективности трансляции (Tennyson et a‘-i 1996). мРНК-транскрипт Dp71 более устойчив по сравнению с полноразмерным транскриптом, так как период его полураспада составляет около 20 часов, тогда как для мРНК Дистрофина — только 16 часов (Tennyson et al., 1995). Идентифицированы различные изоформы апо-дистрофина-1, образующиеся за счет альтернативного сплайсинга последних экзонов гена DMD. Характерным для Dp71 является сплайсирование экзона 78.

Dpi 16 и Dpi40 и Dp260 в дополнение к С-концевым доменам имеют дистальные области стержневого домена дистрофина различной протяженности. Все эти белки также связаны с клеточными мембранами, однако их функции остаются в значительной степени неясными. Апо-дис-

трофин-2 — Dpi 16, преимущественно экспрессируется у взрослых в периферических нервах. Размер мРНК самого маленького апо-дистрофина-3 (Dp40) составляет 2.2 кб (Tinsley et al., 1993). Чисто нейрональной изоформой дистрофина является Dpi40 (Morris et al., 1995). Наиболее интенсивная экспрессия этого белка в мозге наблюдается в эмбриональном периоде. Трансляция Dpi40 начинается с 51 экзона гена дистрофина, а промотор и первый экзон этой последовательности локализованы в 44 интроне гена DMD. Показано, что снижение интеллекта, которое характерно для части больных с миодистрофией Дюшенна, достоверно коррелирует с делециями в районе экзонов 4052 гена DMD. Эти делеции могут затрагивать синтез или функции Dpi40. В плексиформном слое сетчатки глаза избирательно экспрессируется изоформа дистрофина Dp260. Этот апо-дистрофин участвует в контроле нормальной электрофизиологической функции сетчатки (D’Souza et al., 1995). Апо-дистрофины, так же как и полноразмерные дистрофины, способны взаимодействовать с белками дистрофин-ассоциированного комплекса. Однако из-за отсутствия в их структуре N-терминальной части дистрофина эти белки не способны взаимодействовать с актином и потому их функции не связаны с поддержанием це­

лостности мембран мышечных волокон.

Уровень транскрипции полноразмерного мышечного дистрофина в процессе дифференцировки миобластов возрастает примерно в 10 раз. Однако активность мышечного промотора в зрелых миофибриллах в 30 раз ниже, чем в незрелых мышечных волокнах — миотубулах, что указывает на существование дополнительных транскрипционных элементов, вовлеченных в регуляцию экспрессии гена DMD s мышцах (Klamut et al., 1996). Одним из них является 5-кб энхансер, локализованный внутри первого мышечного интрона. Этот элемент специфическим образом активируется в мышцах. В генно-инженерных опытах in vitro было показано, что мышечный DMD-энхансер обеспечивает повышенный уровень экспрессии генов-репортеров независимо от своего положения и ориентировки. По-видимому, существуют и дополнительные подобные элементы в других частях гена DMD.

Высококонсервативные последовательности шести экзонов, кодирующих С-конец дистрофина, альтернативно сплайсируются, образуя несколько структурно различающихся изоформ дистрофина, осуществляющих различные функции. Очевидно, что продукты дистрофинового гена могут взаимодействовать со множеством различных белков и не только в мышечных и нейрональных тканях (Monaco, 1989). В настоящее время функции многочисленных изоформ дистрофина, обильно экспрессирующихся в различных специализированных тканях и способных взаимодействовать со множеством белков и не только мышечного или нейронального

происхождения, изучены явно недостаточно.

6. Риртрпфин-ассоииированный комплекс белков

Связь цитоскелета мышечной клетки с экстраклеточным матриксом осуществляется за счет взаимодействия полноразмерного дистрофина с дистрофин-ассоциированным комплексом белков. При разрушении этого комплекса мышечные волокна теряют свою структурную целостность и погибают. Кроме того, связывание различных изоФ°рм дистрофина с сарколеммой необходимо для их нормального функционирования в центральной нервной системе. Оказалось, что дистрофин-ассоциированный комплекс белков имеет гораздо более сложную структуру, чем это представлялось вначале, и в нем могут быть выделены три отдельных субкомплекса — дистрогликановый, саркогликановый и синтрофиновый (рис. 7).

        Рис.        7. Дистрофин-ассоциированный комплекс белков

В первый субкомплекс входят два гликопротеина, являющиеся коровыми белками для всего комплекса — большой экстраклеточный белок ct-дистрогликан (156DAG) и непосредственно взаимодействующий с ним трансмембранный р-дистрогликан (43DAG или АЗа). Заякоревание дистрофина на внутренней поверхности сарколеммы обеспечивается за счет его связывания с цитоплазматическим хвостом р-дистрогликана (Suzuki et al., 1994). а-дистрогликан, взаимодействуя с компонентом базальной мембраны ламинином 2 (или мерозином), обеспечивает связь между внеклеточным матриксом и сарколеммой, а через дистрофин — и с цитоскелетом клетки. Ламинин-связанный а-дистрогликан, соединенный с экстраклеточным участком р-дистрогликана, формирует дистрогликановый субкомплекс (Suzuki et al., 1995). Участок связывания дистрофина с р-дистрогликаном, начинающийся в цистеин-богатом районе дистрофина и захватывающий часть концевого С-домена, имеет огромное значение для функционирования полноразмерных и укороченных изоформ дистрофина. Так, одна из редких миссенс-мутаций в гене DMD — C3340Y, сопровождающаяся заменой консервативного цистеина в дистрогликан-связывающем домене, приво­

дит к тяжелой форме миодистрофии Дюшенна в комплексе с умственной отсталостью и отсутствием b-волны на электроретинограмме (Lenk et al., 1996). Участок связывания дистрофина с р-дистрогликаном содержит три пептидных мотива, найденных в других неродственных дистрофину белках — WW, EF, ZZ. Эти мотивы кодируются экзонами (63), (65-66), (68-69), соответственно. Интересно, что р-дистрогликан способен связываться с src-гомологичным доменом SH3 одного из адапторных белков (Grb2). SH3 — высококонсервативная некаталитическая последовательность, участвующая в образовании стабильного комплекса между scr-киназами и другими сигнальными молекулами, включая рецепторы. Предполагается, что b-дистрогликан взаимодействует с WW-участком дистрофина посредством атипичных ЭНЗ-связывающих модулей (Yang et al., 1995). EF-последовательность может участвовать в связывании кальция. ZZ-мотив способен связывать бивалентные катионы металлов, в частности цинка.

Показано, что а- и р-дистрогликаны являются альтернативными продуктами одного гена DAG1, картированного в области 3р21 (Ibragimov-Beskrovnaya et al., 1992; 1993). Соответствующий белковый продукт, транслирующийся с мРНК размером 5.5 кб, расщепляется на две нековалентно-ассоЦиированные субъединицы — а и р . Ген DAG1, состоящий из Двух разделенных большим интроном экзонов, экспрессирувтся во множестве типов тканей. В опытах на мышах показан высокий уровень экспрессии этого гена в раннем эмбриогенезе. Дистрогликаны обнаруживаются в децидуальной ткани уже на периимплантационной стадии развития (Yotsumoto et al., 1996). По-видимому, в этот период они выполняют роль медиаторов для адгезии между децидуальными клетками или между децидуальными и трофобластными клетками. Присутствие дистрогликанов необходимо для формирования одной из первых оболочек зародыша — Рейхеротовской мембраны (Williamson et al., 1997). Роль дистрогликанов в различных специализированных тканях во многом остается неясной.

В нейромышечных соединениях а-дистрогликан является функциональным рецептором для агрина — нейронально секретируемого гликопротеина, индуцирующего кластерирование ацетилхолиновых рецепторов и последующую реорганизацию постсинаптического цитоскелета (Sealock, Froehner 1994). В ряде работ было показано, что в культивируемых миотубулах антидистрогликановые антитела ухудшают кластерирование ацетилхолиновых рецепторов (Campanelli et al., 1994; Gee et al., 1994). Показано, что домен агрина, ответственный за кластерирование ацетилхолиновых рецепторов, физически отделен от домена, осуществляющего связь с дистрогликаном (Gesemann et al., 1996). Поэтому представляется более вероятным, что дистрогликан трансдуцирует сигнал от агрина для начала кластерирования ацетилхолиновых рецепторов через промежуточный белок, которым, по всей видимости является перлекан (Peng et al., 1999). Не исключено, что именно через эту связь осуществляется учас­

тие дистрофина в синаптогенезе.

Другой саркогликановый субкомплекс формируется четырьмя трансмембранными белками и включает а-саркогликан (50DAG или адхалин или А2), р-саркогликан (43DAG или АЗЬ), у-саркогликан (35DAG или А4) и 5-саркогликан (35DAG). В этот субкомплекс, по-видимому, входит 25DAP (А5 или саркоспан). Связь саркогликанового субкомплекса с дис-

трофином осуществляется посредством его взаимодействия с цитоплазматическим участком 35DAG. Для сохранения стабильности всего саркогликанового комплекса особое значение имеет карбокси-терминальный район у-саркогликана. В настоящее время все гены, кодирующие саркогликаны, картированы и клонированы. Мутации в саркогликановых генах являются причиной развития различных аутосомно-рецессивн ь 1 Х дюшенно-подобных и конечностно-поясных миодистрофии.

Третий синтрофиновый субкомплекс образован четырьмя ассоциированными с дистрофином цитоплазматическими белками — тремя 59DAP, получившими название синтрофинов или А1 триплета (а-А1, р1 -А1 и р2-А1), а также минорными белками комплекса, относящимися к группе дистробревинов (АО). Синтрофины связываются с участком С-концевого домена дистрофина, кодируемым экзонами 73-74, альтернативно сплайсирующимися во многих типах тканей на разных стадиях развития (Suzuki et al., 1994; Ahn, Kunkel, 1995). В частности, р1-синтрофин специфически связывается с расположенной в концевом С-домене последовательностью из 53 аминокислот, кодируемой 74 экзоном дистрофина. а-синтрофин связывается с другим участком дистрофина, локализованным в непосредственной близости от сайта связывания р1-синтрофина (Suzuki et al., 1995). Возможно,

дистробревин участвует в связи между дистрофином и саркогликановым субкомплексом. Синтрофины, по-видимому, являются сигнальными медиаторами, так как они содержат протеин-связывающие домены (PDZ). Они могут опосредовать соединение дистрофин-ассоциированного комплекса белков с киназами, натриевыми каналами и nNOS. Предполагается также их участие в пострансляционных модификациях DAP-комплекса в мышцах в ответ на изменение механического стресса. Синтрофины, локализованные в нейромышечных соединениях, и в первую очередь р2-синтрофин, по-видимому, принимают участие в синаптогенезе.

Дистробревины относятся к семейству дистрофин-

Родственных белков. Их гомология с дистрофином в области цистеин-богатого домена достигает 57%. Ген дистробРевина картирован в области 18q12.1-12.2 и кодирует семейство белков, главными изоформами которых в мышЧах являются дистробревин-1 (94 кД), дистробревин-2 (62

КД) и дистробревин-3 (42 кД) (Sadoulet-Puccio et al., 1996; Metzinger et al., 1997). Обнаружено не менее 5 различных транскриптов гена дистробревина, три из которых присутствуют в мозге. Фосфорилированный по тирозину дистробревин с молекулярной массой 94 кД имеет 90% гомологии с 87 кД постсинаптическим белком электрического ската Torpedo (Wagner et al., 1993). He исключено участие дистробревинов в синаптогенезе, так как они вычищаются в комплексе с ацетилхолиновыми рецепторами. Хотя у Torpedo дистробревин также ассоциирован с синтрофинами и дистрофином, прямого взаимодействия между этим комплексом и ацетилхолиновыми рецепторами не обнаружено. Иммуногистохимические исследования показывают, что уровни дистробревина в сарколемме пациентов с миодистрофией Дюшенна и, в меньшей степени, Беккера резко снижены. Однако присутствия дистрофина недостаточно для правильной локализации дистробревинов в сарко­

лемме, так как аналогичное снижение наблюдается и у пациентов с конечностно-поясными мышечными дистрофиями, обусловленными дефектами в саркогликановых генах.

В целом организация дистрофин-гликопротеинового комплекса очень сходна со структурой кадхеринов или интегринов, а сам этот комплекс является важнейшим элементом архитектуры мышечных клеток. Очевидно, что во многих типах клеток позвоночных белки дистрофинового семейства выполняют критическую роль в поддержании ассоциированных с мембраной комплексов в местах межклеточных контактов. Но на этом их функция не ограничивается. Наличие многочисленных сайтов фосфорилирования в цистеин-богатом домене, присутствующем во всех

дистрофин-родственных белках, и возможность его связывания с кальцием, магнием и кальмодулином доказывают активное участие этих белков в передаче сигналов через мембрану мышечного волокна (Michalak et al., 1996).Для большинства дистрофин-ассоциированных белков выпускаются в настоящее время коммерческие антитела.

На рис. 8 схематически изображены связи между белками дистрофин-ассоциированного комплекса.

Рис.                                   8. Связи между белками дистрофин-ассоциированного комплекса

7. Анализ корреляций генотип-фенотип. Дюшенно-подобные аутосомно-реиессивные миопатии

Анализ корреляций между клиническим течением миодистрофии Дюшенна/Беккера и делециями без сдвига рамки считывания, затрагивающими специфические домены белкового продукта DMD, позволяет строить своеобразную

«патофункциональную» карту дистрофина (Ahn, Kunkel, 1993). Показано, что N-концевые делеций приводят к гетерогенным, но достаточно серьезным формам Беккера. Делеций проксимальной части стержневого домена связаны с очень мягким или атипичным фенотипом, тогда как

Дистальные делеций этого же домена дают типичные формы Беккера. За некоторым исключением делеции двух Сконцевых доменов реализуются в виде миодистрофии Дюшенна.

У больных с миодистрофией Дюшенна/Беккера количественное содержание всех белков гликопротеинового комплекса, в том числе и внеклеточного альфа-дистрогликана (156DAG), значительно понижено и одновременно повышен уровень кальция скелетных мышц, «аким образом, аномальная экспрессия дистрофина может оказывать влияние на внешние компоненты мышечных вогокон вследствие разрушения дистрофин-ассоциированно’о комплекса, нарушения целостности или эластичности сарколеммы, ведущего либо к ее механическому повреждению, либо к изменению механизмов регуляции кальция. Потеря экстраклеточного гликопротеина является, по-видимому, первым шагом в молекулярной цепи патогенеза данных форм миодистрофии.

Не исключено, что делеции в некодируюдих областях DMD, специфическим образом нарушающее экспрессию определенных изоформ дистрофина вследствие избирательного разрушения промоторных областей для соответствующих транскриптов, могут реализоваться в сцепленные с полом заболевания, не сопровождающиеся мышечной дистрофией. Так, было показано, что делеции области локализации мышечного промотора, а также точковые мутации в 5′-сайте сплайсинга первого экзона DMD являются причиной одной из форм тяжелой Х-сцепленной

дилатационной кардиомиопатии, протекающей без проявлений симптомов мышечной слабости (Muntoni etal., 1995а; Milasin et al., 1996). Распространенность дилатационной кардиомиопатии в США составляет 36.5 на 100 000. Примерно для 20% подобных случаев показано менделевское наследование различного типа — аутосомно-доминантное, аутосомно-рецессивное и сцепленное с полом. При этом не наблюдается никаких клинических различий между семейными и спорадическими случаями заболевания. Генетический анализ семей, в которых наблюдалась сегрегация по сцепленной с полом форме дилатационной кардиомиопатий, показал, что ген, ответственный за развитие заболевания, локализован в той же области Хр21, где находится ген DMD (Towbin et al., 1993). Спустя некоторое время у ряда больных с семейной Х-сцепленной формой дилатационной кардиомиопатий, так же как и в нескольких спорадических случаях у мужчин, были идентифицированы мутации в гене DMD. Это были либо делеции,затрагивающие регуляторную область и первый экзон DMD, либо сплайсинговые мутации, локализованные в начале первого интрона гена дистрофина (Yoshida et al., 1993; Muntoni

et al., 1995b; Milasin et al., 1996). У трех пациентов с Х-сцепленной дилатационной кардиомиопатией из двух неродственных японских семей была обнаружена уникальная инсерция транспозоно-подобного элемента L1 в первом экзоне гена DMD (Yoshida et al., 1998). В дальнейшем были определены начальные этапы молекулярного патогенеза подобных форм дилатационной кардиомиопатий. Оказалось, что идентифицированные мутации приводят к полному отсутствию мышечной изоформы дистрофина у больных. Кроме того, в миокарде пациентов отсутствует экспрессия двух других полноразмерных изоформ мРНК дис­

трофина, транскрибирующихся с промоторов мозгового типа. В отличие от этого, в скелетных мышцах наблюдается достаточно высокий уровень двух полноразмерных изоформ дистрофина мозгового типа и потому сохраняется дистрофин-гликопротеиновый комплекс. В сердечной мышце не происходит компенсаторной экспрессии дистрофина с альтернативных промоторов и дистрофин-гликопротеиновый комплекс полностью разрушен, несмотря на присутствие там апо-дистрофина-1. В результате у пациентов развивается дилатационная кардиомиопатия без каких-либо проявлений слабости скелетной мускулатуры.

Вскоре вслед за описанием молекулярного дефекта п Ри Х-сцепленной дилатационной кардиомиопатий у больных с аутосомно-рецессивными формами заболевания были обнаружены мутации в двух группах генов. Одни гены оказались связаны с белками дистрофин-ассоциированного комплекса, такими как а-дистрогликан, а- и у-саркогликаны, другие гены — с белками цитоскелета мышечной клетки: метавинкулином, актином, мышечным белком, участвующим в позитивной регуляции миогенеза, так называемым LIM-белком (Towbin, 1998). Примечательно, что иден­

тифицированные у пациентов мутации в актиновом гене приводили к дефекту того домена актина, который участвует во взаимодействии с дистрофином. Дефект 5-саркогликана найден в линии хомячка BI014.6 с кардиомиопатией. Все эти факты свидетельствуют о центральной роли дистрофин-ассоциированного комплекса в функционировании кардиомиоцитов. Не исключено, что и приобретенные формы дилатационной кардиомиопатии, доля которых достигает 30% от общего числа дилатационных кардиомиопатии, связана с нарушением нормальной работы дистрофина. Энтеровирусы, и в частности вирусы Коксаки, способны индуцировать дилатационную кардиомиопатию. Оказалось, что единственным белком человека, который расщепляется вирусной протеазой 2А, является дистрофин. Это было предсказано на базе компьютерного анализа и подтверждено в опытах in vitro (Badorf et al., 1999). Дистрофин также расщепляется в культивируемых миоцитах, зараженных вирусом Коксаки, и in vivo в сердечной мышце инфицированных мышей. При этом в инфицированных миоцитах отсутствует не только дистрофин, но и ассоциированные с ним гликопротеины — а-саркогликан и р-дистрогликан. Очевидно, что разрушение дистрофинового комплекса является одним из центральных звеньев в этиологии дилатационных кардиомиопатии.

Экспрессия дистрофина и Dp260 обнаружена во внешнем плексиформном слое сетчатки глаза, где фоторецеп-

торные клетки взаимодействуют с нейронами ганглиев, в то время как другой апо-дистрофин — Dp71 — экспрессипуется на внутренней ограничивающей мембране сетчатки и на ее сосудах (Fillers et al., 1993; Howard et al., 1998). у некоторых пациентов с миодистрофией Дюшенна /Беккера и у мышей генетических линий mdx с мутациями в гене Dmd выявлен аномальный характер электроретинограмм, причем степень аномалий зависит от типа мутационных повреждений.У трансгенных мышей с направленно разрушенным экзоном 52 гена Dmd и отсутствием экспрессии Dp260 изменена локализация р-дистрогликана и обнаруживаются аномалии на электроретинограмме (Катеуа et al., 1998). Показано, что присутствие каждого из двух аподистрофинов — Dp71 и Dp260 — необходимо для правильной локализации р-дистрогликана, а это взаимодействие, в свою очередь, имеет важное значение для исполнения нормальной электрофизиологической функции сетчатки. Не исключено, что некоторые мутации в гене DMD, сопровождающиеся образованием дефектных форм дистрофина и аподистрофинов Dp71 и Dp260, могут быть ответственны за развитие Х-сцепленной формы ночной слепоты, ген которой также картирован в области Хр21.

Кроме того, полноразмерный дистрофии и его укороченная форма Dpi 16 активно экспрессируются во внутренних и внешних волосковых клетках улитки, где эти белки преимущественно располагаются на латеральной поверхности и в синаптических районах (Dodson et al., 1995). Ген, ответственный за развитие одной из моногенных форм нейросенсорной тугоухости, также картирован в области Хр21 недалеко от DMD (Lalvani et al., 1994). Возможно, дистрофины участвуют в трансдукции акустического сигнала в нейрональный и некоторые их дефекты или дефекты дис-

т Рофин-гликопротеинового комплекса ответственны за °пределенные типы нейросенсорной тугоухости. Не исключено также, что делеций в 44-м интроне, «горячей» точке В н Утригенной рекомбинации, специфически разрушающие пРомоторную область для наиболее интенсивно экспрес-

С и Рующегося в раннем эмбриогенезе нейронального апо-

 

дистрофина Dpi40, могут приводить к одной из форм Х-сцепленной изолированной умственной отсталости, ген которой также локализован в области Хр21.

Предполагается, что среди семей с миодистрофией дюшенновского типа в 6.8% случаев наследование осуществляется по аутосомно-рецессивному типу (Zatz et al., 1989). По оценкам этих же авторов, доля мальчиков с аутосомнорецессивным типом наследования среди изолированных случаев миодистрофии Дюшенна составляет 2.5-4%. Аномалии

дистрофин-связанных белков в сарколемме — первый общий шаг в патологическом процессе, ведущем к некрозу мышечных клеток, не только при Х-сцепленной форме миодистрофии Дюшенна, но и при тяжелых аутосомно-рецессивных

дюшенно-подобных миодистрофиях, так же как и при миодистрофии Фукуяма.

Дюшенно-подобные формы миодистрофии представляют собой генетически гетерогенную группу аутосомнорецессивных заболеваний. Чаще всего такие семьи выяв­

ляют потому, что в них наблюдаются девочки с клиникой миодистрофии Дюшенна. При этом у больных девочек не находят каких-либо структурных аномалий, затрагивающих Х-хромосому. В частности, необычно высокая частота тяжелой прогрессирующей мышечной дистрофии с аутосомно-рецессивным характером наследования описана в Тунисе (Ben Hamida et al., 1983). Из 93 диагностированных пациентов 75 принадлежали 17 семьям, в которых присутствовали больные обоих полов, и 18 принадлежали 11 семьям, в которых больными были только девочки. Оказа­

лось, что в большинстве случаев аутосомно-рецессивные дюшенно-подобные формы миодистрофии обусловлены мутациями в генах, кодирующих белки дистрофин-ассоциированного комплекса. В табл. 7 суммированы данные по локализации таких генов и их связи с наследственными заболеваниями.

Таблица 7 Связь генов, кодирующих белки дистрофин-ассоциированного       комплекса, с   наследственными    заболеваниями

Белок

Ген

Локализация

Заболевание

а-саркогликан, адхалин

SGA, aSG,

ADL,

DAG2

17q21

первичная адхалинопатия; SCARMD*); конечностнопоясная миодистрофия 2D;

дилатационная кардиомиопатия

р- саркогликан

SGB, pSG

4q12

конечностно-поясная миодистрофия 2Е; ARMD**

у-саркогликан

SGG, ySG

13q12

конечностно-поясная миодистрофия 2С; SCARMD; дилатационная кардиомиопатия

S-саркогликан

SGD, 8SG

5q33

конечностно-поясная миодистрофия 2F

а- дистрогликан

DAG1

3p21

дилатационная

кардиомиопатия

р- дистрогликан

DAG1

3p21

не найдено

Дистробревин

DRP3

18q12.1-1

2.2

не найдено

Ламинин 2, мерозин

LAMA

6q22-q23

миодистрофия врожденная мерозин дефицитная

*) SCARMD — тяжелая детская аутосомно-рецессивная мышечная дистрофия.

**) ARMD аутосомно-рецессивная мышечная дистрофия Дюшенновского типа.

В ряде семей с тяжелой формой детской аутосомноРецессивной мышечной дистрофией (SCARMD), впервые описанной в большой тунисской семье, при сохранении нормальных уровней дистрофина наблюдали выраженный дефицит a-саркогликана, называемого иначе адхалином или 50DAG (Matsumura etal., 1992; Piccolo et al., 1995). Во многих

5 ^каз № 170

таких семьях этот дефект является вторичным. В относительно небольшом проценте семей подобный дефект является первичным, то есть обусловлен мутациями в гене а-саркогликана -aSG или ADL, картированном в области 17р21

(McNally et al., 1994).

Такая форма очень варьирующей по степени тяжести аутосомно-рецессивной мышечной дистрофии получила название первичной адхалинопатии. Для пациентов с первичной адхалинопатией характерным является преимущественное поражение проксимальных мышц, высокие уровни сывороточной креатинкиназы, нормальное содержание дистрофина, сохранный интеллект. Дебют и степень выраженности клинических симптомов могут варьировать от ранних и тяжелых форм до поздних с минимальными проявлениями мышечной слабости. Примерно в 25% случаев у больных с первичной адхалинопатией обнаруживается однотипная миссенс-мутация R77C в гене ADL (Roberds et al. 1994). Пациенты с этой мутацией были найдены в семьях различного этнического происхождения из Франции, Германии, Африки, США. В дальнейшем эта форма миопатии была классифицирована, как один из генетических вариантов конечностно-поясных миодистрофии, обусловленных наследственными дефек­

тами белков саркогликанового комплекса.

Аномально низкий уровень экспрессии саркогликанов и дистрогликанов обнаружен у пациентов в Японии с врож­

денной аутосомно-рецессивной прогрессирующей мышечной дистрофией типа Фукуяма, сочетающейся с умственной отсталостью (см. ниже). Однако и в данном случае эти

дефекты являются вторичными, так как прослежено сцепление заболевания с маркерами длинного плеча хромосомы 9 (9q31-q33).

Картированы и клонированы гены, кодирующие другие белки саркогликанового субкомплекса. Мутации в этих генах сопровождаются разрушением этого субкомплекса и реализуются либо в виде различных форм миодистрофии плечевого и тазового пояса (Lim et al., 1995), либо в виде аутосомнорецессивной мышечной дистрофии (ARMD) дюшенновского типа (Bonnemann et al., 1995).

DAG1 рассматривался в качестве кандидатного гена при различных аутосомно-рецессивных формах миодистрофии. Однако до сих пор в этом гене не обнаружено никаких мутаций, приводящих к наследственным миопатиям. По-видимому, важная роль дистрогликанов в формировании оболочек плода приводит к тому, что большая часть мутантов по DAG1 гену погибают в раннем эмбриогенезе. Мы уже упоминали о том, что дефекты в а-дистрогликане обнаруживаются у некоторых пациентов с аутосомно-рецессивными формами дилатационной кардиомиопатий.

При иммуногистохимическом анализе биоптатов мышц более 500 пациентов с различными формами миопатии, у которых был сохранен нормальный уровень дистрофина, в 10% случаев наблюдали отсутствие окрашивания на ос-саркогликан (Duggan et al., 1997). В 60% этих случаев были обнаружены мутации в саркогликановых генах. Большая часть из них (58%) оказалась локализована в гене адхалина, 27% и 13% в генах р- и у-саркогликанов, соответственно. Чаще всего такие мутации обнаруживаются у пациентов с тяжелыми

дюшенно-подобными формами миодистрофии, дебютирующими в детском возрасте. Среди проксимальных форм с поздним началом подобные мутации были найдены в 6% случаев.

8. Семейство DMD-родственных генов

Обнаружен аутосомный гомолог гена DMD, локализованный в области 6q24, — ген UTRN или DRP1, кодирующий дистрофин-родственный белок с молекулярной массой в 395 кД — утрофин (табл. 8). Показано, что утрофин в ряде случаев может выступать в качестве функционального гомолога Дистрофина. Геномная область, занимаемая UTRN, почти втрое меньше гена DMD и составляет 900 кб. Размеры РНК»Фанскриптов этих двух генов близки — величина мРНК DMD составляет 14 кб, a UTRN — 13 кб (Blake et al., 1996). Ген UTRN активно экспрессируется в нейромышечных и в мышечно-сухожильных соединениях, в мозге и в дополнение к этому во многих других висцеральных тканях, в первую очередь — в легких. Интересно подчеркнуть, что регуляция экспрессии генов DMD и UTRN осуществляется, по-видимому, аналогичным образом. Так, обнаружен 5.5-кб транскрипт этого гена, преимущественно экспрессирующийся в сенсорных ганглиях и в мозге, кодирующий 113 кД белок G-утрофин, гомологичный апо-дистрофину периферических нервов Dpi 16 (Blake et al., 1995). Описан также 80 кД утрофин, который, по-видимому, является аутосомным гомологом Dp71

(Fabbrizio et al., 1995a).

Кроме того, в области Xq22 идентифицирован другой небольшой ген, гомологичный З’-концу DMD — DRP2 (Roberts et al., 1996). Этот ген занимает 45 кб геномной ДНК, его ко­

дирующая область разделена на 24 экзона. Продуктом гена DRP2 является 110-кД белок, состоящий из 956 аминокислот.

Ген DRP2 преимущественно экспрессируется в головном и в спинном мозге, и его продуктом является белок, родственный Dpi 16. Прослежена эволюционная связь между дистрофин-родственными генами млекопитающих и их предшественниками у беспозвоночных (Roberts,Bobrow, 1998). По-ви­

димому, у большинства беспозвоночных имеется один ген, кодирующий высококонсервативный дистрофин-родственный белок, в дополнение к гену дистробревина (DRP3), имеющему более отдаленное сходство с дистрофином. Дистрофинродственный ген и ген дистробревина произошли от гена-предшественника путем более ранней дупликации. У позвоночных дистрофин-родственный ген подвергался серии дупликаций, приведших к образованию покрайней мере трех от­

дельных генов (DMD, UTRN и DRP2), способных выполнять различные специализированные функции.

Недавно был изолирован ген морского ежа, который, по-видимому, является предшественником генов дистрофина и утрофина (Wang et al., 1998). Более чем 300-кД продукт этого гена содержит покрайней мере 3 из четырех доменов дистрофина. В этом гене также обнаружено несколько промоторов и его наименьший продукт, по-видимому, родственен Dpi 16. Предложена модель, согласно которой ген DRP2, кодирующий Ор116-родственный белок, также эволюционировал от этого гена-предшественника путем дупликации его небольшой части. В настоящее время никаких мутаций в генах UTRN, DRP2 и DRP3 не описано.

Таблица 8

Семейство DMD-родственных генов

Ген

Локализация

Размер

гена (кб)

Размер мРНК

(Кб)

Основной продукт

DMD

Хр21

2500

14

дистрофии

UTRN, DRP1

6q24

900

13

утрофин

DRP2

Xq22

45

2.8

дистрофин-род-

ственный белок 2

DRP3

18q12.1-12.2

дистробревин

395-кД утрофин также относится к спектрин/а-актининовому семейству белков. Он имеет доменную организацию, гомологичную дистрофину. При этом сходство его актин-связывающего, цистеин-богатого и С-концевого доменов с соответствующими доменами дистрофина достигает 85—88%. Наибольшие различия касаются стержневого домена, состоящего в утрофине из 22 повторяющихся спектрин-подобных сегментов, прерванных двумя петлеобразными районами. G-утрофин содержит уникальный N-конец, небольшой фрагмент стержневого домена, включающий два спектрин-подобных повтора и последний петлеобразный район, а также цистеин-богатый и С-концевой домены утрофина. Показано, что утрофин подобно дистрофину способен взаимодействовать с компонентами дистрофин-гликопротеинового комплекса и выполнять сходные функции, то есть дистрофин и утрофин, по-видимому, являются функциональными гомологами. Другой дистрофин-родственный белок, кодируемый геном DRP2, содержит короткий пролин-богатый район, два спектрин-по-

добных повтора стержневого домена и последовательность, гомологичную последующим доменам дистрофина и утрофина — цистеин-богатому и С-концевому. Найдено большое сходство между Dpi 16 изоформой дистрофина и дистрофинродственным белком drp2 (Roberts et al., 1996). Хотя точные функции G-утрофина и drp2 неизвестны, они могут подобно апо-дистрофинам связываться с р-дистрогликаном.

В раннем эмбриогенезе утрофин присутствует в сарколемме скелетных мышц, занимая сходное с дистрофином положение (Clerk et al., 1993). По-видимому, высокая скорость

деления клеток в этот период не позволяет транскрибироваться такому крупному гену, как DMD. Однако в дальнейшем дистрофин постепенно замещает утрофин в сарколемме мышц и начиная с 26 недель беременности утрофин там уже не обнаруживается, а экспрессируется только в нейромышечных и мышечно-сухожильных соединениях, причем его

локализация в этих сайтах отлична от локализации дистрофина. В сердечной мышце утрофин находят в интерколярных дисках, тогда как дистрофин располагается преимущественно по периферии кардиоцитов.

Можно считать доказанным участие утрофина в синаптогенезе. Показано, что взаимодействие сс-дистрогликана с агрином и перлеканом, стимулирующее в дальнейшем кластерирование ацетилхолиновых рецепторов, осуществляется в тех случаях, когда этот гликопротеин находится в комплексе с утрофином. На рис. 9 изображена структура утрофинассоциированного комплекса белков в нейромышечных соединениях. Оказалось, что утрофин, в отличие от дистрофина, способен взаимодействовать с рапсином, содержащим 43кД цинк-фингерный домен и принимающим непосредственное участие в перекрестной сшивке ацетилхолиновых рецепторов с образованием микрокластеров (Phillips et al., 1993).

 

Индукция образования больших кластеров происходит с участием а-дистрогликана, по-видимому, посредством его взаимодействия с ламинином (Chamberlain, 1999). Утрофин может играть роль стабилизатора подобных кластеров для установления точечных контактов между рецепторными агрега­

тами и цитоскелетом. Трансгенное разрушение рапсинового гена у мышей сопровождается образованием аберрантных нейромышечных соединений в результате потери способности к кластерированию ацетилхолиновых рецепторов, что и приводит к ранней гибели животных (Gautam et al., 1995). Таким образом, рапсин обеспечивает связь между ацетилхолиновыми рецепторами и агрин-связанным утрофин-ассоциированным гликопротеиновым комплексом (Apel et al., 1995). Еще одним отличием утрофин-ассоциированного комплекса белков является его ассоциация с микротрубочками, осуществляемая посредством взаимодействия цистеин-богатого домена утрофина со специфической серин/треонинкиназой (MAST).

Рис. 9. Структура утрофин-ассоциированного комплекса белков в нейромышечных соединениях

Интересно подчеркнуть, что з мышцах пациентов с миодистрофией Дюшенна утрофин присутствует в сарколемме, причем в положениях, характерных для дистрофина. Это связано с посттрансляционными изменениями, а не с увеличением скорости его транскрипции. Подобные нарушения в регуляции распределения утрофина наблюдаются при дерматомиозитах и полрмиозитах. По-видимому, перераспределение утрофина возникает при регенерации мышцы и может служить компенсаторным механизмом, частично защищающим мышечное волокно от дальнейших раундов дегенерации и регенерации.

9. Линии мышей, моделирующие миодистоофию

Дюшенна/Беккера

Успешному анализу особенностей организации гена дистрофина и изучению молекулярных основ патогенеза миодистрофии Дюшенна способствовали параллельные исследования, выполненные на модельной линии мышей — mdx. Эта модель была получена в результате отбора мутации, спонтанно возникшей в одной из линий мышей дикого типа (Bulfield et al., 1984). В мышцах и в мозге у мышей этой линии резко снижено количестЕО Dmd-мРНК и не обнаруживаются иммунологические формы дистрофина. Идентифицирована нонсенс-мутация в экзоне 23 гена Dmd у животных линии mdx, в результате <оторой транслируется лишь 27% дистрофинового полипептида. У mdx мышей, так же как у больных с миодистрофией Дюшенна, значительно повышен уровень сывороточной креатинкиназы. Несмотря на это, заметных фенотипинеских отклонений от нормы у мутантных мышей не наблодается. Однако при гистологическом исследовании скелетных мышц конечностей и диафрагмы животных обнаруживаются зоны экстенсивной дегенерации и регенерации с многочисленными патологическими признаками мышечной дистрофии, включая некрозы, вариации по величине мышечных волокон, центральную, а не периферическую локализацию ядер в регенерирующих волокнах. У модельных mdx мышей, так же как и у пациентов с миодистрофией Дюшенна/Беккера, оказывается разрушен ассоциированный с дистрофином гликопротеиновый комплекс.

Дополнительно путем индуцированного мутагенеза и селекции были получены еще четыре линии mdx-мышей, в которых проведена молекулярная идентификация мутантных аллелей в гене Dmd (Сох et al., 1993b; lm et al., 1996). Фенотип мышей всех пяти mdx-линий по характеру мышечной патологии очень сходен. Из-за присутствия различных точковых мутаций в гене Dmd животных этих линий ни в их мышцах, ни в мозге не экспрессируется полноразмерный дистрофии. Две из этих мутаций нонсенс типа, то есть создают преждевременный стоп-кодон, а три нарушают процесс сплайсинга первичного РНК-транскрипта. В результате различного расположения мутаций относительно внутренних промоторов гена Dmd исследуемые мутантные линии различаются по набору экспрессирующихся укороченных изоформ дистрофина. Таким образом, эти генетические линии представляют собой идеальную систему для анализа функций множественных изоформ дистрофина.

У мутантных мышей, не экспрессирующих основной продукт гена DMD в немышечных тканях — апо-дистрофин-1, уровень дистрофин-ассоциированных белков в мозге значительно снижен, что указывает на важную роль этой укороченной изоформы дистрофина для формирования и/или стабилизации DAP-комплекса в центральной нервной системе (Greenberg et al., 1996).

На базе mdx-мышей были сконструированы трансгенные линии животных, в которых при отсутствии дистрофина наблюдается эктопическая экспрессия Dp71 (Сох et al., 1994; Greenberg et al., 1994). Оказалось, что, в отличие от mdx-мышей, у трансгенных животных апо-дистрофин-1 присутствует в сарколемме скелетных мышц. Кроме того, при экспрессии Dp71 содержание дистрофин-ассоциированных белков — 59DAP, 50DAG и 43DAG — поднимается до нормальных уровней и апо-дистрофин-1 оказывается способен таким же образом, как и дистрофин, взаимодействовать с этими белками, реконструируя дистрофин-гликопро-

теиновый комплекс. Несмотря на это, признаки мышечной дистрофии, характерные для mdx-мышей — некрозы, варьирующая величина миофибрилл и центральное располо­

жение ядер в регенерирующих волокнах, а также высокий уровень сывороточной креатинкиназы, не только сохраняются при трансгенозе Dp71, но даже в некоторой степени усиливаются. Таким образом, само по себе восстановление дистрофин-гликопротеинового комплекса недостаточно для предотвращения мышечной дистрофии. Для сохранения целостности мышечной мембраны, по-видимому, необходимо взаимодействие N-концевого участка дистрофина с актиновыми филаментами цитоскелета миофибрилл.

Отсутствие клинических проявлений миодистрофии у mdx мышей частично может быть объяснено компенсаторным действием утрофина. В частности, с этим, по-видимому, связан тот парадоксальный факт, что у mdx-мышей, в отличие от больных миодистрофией Дюшенна, не наблюдается сердечной недостаточности. Действительно, в сердечной мышце мышей в норме уровень утрофина оказался в четыре раза выше, чем у человека. У дистрофин-дефицитных мышей, так же как и у пациентов с миодистрофией Дюшенна/Беккера, содержание утрофина в сарколемме мышц значительно повышено, причем это связано с посттрансляционными изменениями, а не с увеличением скорости его транскрипции.

Для изучения роли комплементарного действия дистрофина и утрофина в патогенезе миодистрофии Дюшенна была сконструирована серия трансгенных линий мышей с различными сочетаниями дефектов в генах Dmd и Utrn

(Deconinck et al., 1997; Grady etal., 1997; Gilbert etal., 1998; Rafael et al., 1998) (табл. 9). Оказалось, что аденовирусное введение трансгена, специфически экспрессирующего в скелетных мышцах укороченную форму утрофина (Tg Utm), приводит к коррекции гистологических аномалий в линиях mdx (Tinsley et al., 1996; Deconinck et al., 1997c). Укороченный трансген кодирует 200-кд белок, содержащий функционально значимые амино- и карбокситерминальные домены утрофина, но не имеющий большей части его стержневого спектрин-подобного района. Трансген работает под контролем а-актининового промотора, обеспечивающего специфическую экспрессию в скелетных, но не в сердечной мышце. В диафрагме и в конечностях мышей линии (Tg Utm; mdx) экзогенный утрофин располагается в сарколемме мышц. У трансгенных животных, в отличие от mdxмышей, значительно сокращена площадь некротических зон и миофибрилл с варьирующей величиной и центральным расположением ядер в регенерирующих волокнах скелетных мышц. Кроме того, у них понижено содержание сывороточной креатинкиназы и улучшены механические свойства мышц, что определяется по многим показателям, включая уровень спонтанной активности животных. Полностью восстанавливается нормальный внутриклеточный гомеостаз кальция, нарушенный у mdx-мышей и у пациентов с миодистрофией Дюшенна. При трансгенозе укороченных форм утрофина, по-видимому, происходит восстановление дистрофин-ассоциированного комплекса белков, так как при иммуногистохимическом анализе биоптатов мышц таких животных с использованием анти-ос-саркогликановых антител появляется специфическое окрашивание в сарколемме.

Инактивация гена Utrn у мышей не приводит к какимлибо заметным фенотипическим аномалиям (Deconinck et al., 1997b). Животные с (1Лгп-/-)-генотипом развиваются нормально и имеют незначительные дефекты, обусловленные небольшими постсинаптическими аномалиями в нейромышечных соединениях. При скрещивании мышей из линий mdx и Utrn-/- удалось получить животных, у которых одновременно

Дефектными оказались оба гена — Dmd и Utrn (Grady et al., 1997a; 1997b). В отличие от мышей родительских линий, особи линии (Utrn-Л; mdx), называемой также Dko, представляют из себя истинную фенокопию миодистрофии Дюшенна. У таких животных наблюдается тяжелая мышечная дистрофия с контрактурами суставов, кардиомиопатией, заметной за­

держкой роста, кифозом. Погибают они на сроке от 6 до 20 недель постнатального развития. У мышей линии Dko при ультразвуковом исследовании наблюдаются структурные аномалии в нейромышечных и мышечно-сухожильных соединениях. При этом в нейромышечных соединениях белки дис­

трофин-ассоциированного комплекса — р-дистрогликан и р2-синтрофин, а также белки ацетилхолино-рецепторных (AchR) комплексов, в том числе рапсин, имеют нормальную локализацию. Таким образом, у двойных мутантов наблюдается тяжелая прогрессирующая мышечная дистрофия при сохранении качественно нормального развития синап-

тической системы.

Удивительным оказалось то, что дистрофин/утрофиндефицитные животные с введенным трансгеном, экспрессирующим в скелетных мышцах укороченную форму утрофина, не имеют аномалий, характерных для мышей линии (Utrn-/-; mdx) (Rafael et al., 1998). Они нормально развиваются и даже спустя год не проявляют каких-либо клинических симптомов миодистрофии, несмотря на то что в сердечной мышце таких животных дистрофин и утрофин полностью отсутствуют. Показано также, что, в отличие от дис-

трофин/утрофин-дефицитных животных, у мышей линии (Тд Utrn; Utrn-/-; mdx;) появляется окрашивание на а-саркогликан в сарколемме мышц и восстанавливается экспрессия некоторых белков, необходимых для нормального развития мышц. Очевидно, что присутствие укороченной формы утрофина в сарколемме мышц мутантов, не имеющих нормального дистрофина и утрофина, способно восстановить дистрофин-ассоциированный комплекс белков, нормальное развитие и функционирование дефектных мышц.

 

Таблица 9 Характеристика мышей, дефектных по дистрофиновому (Dmd) и/или утрофиновому (Utrn) генам

Линии мышей

Характер дефекта

Экспрессия дистрофина

Экспрессия утрофина

Фенотип

mdx

точковые

мутации в Dmd

укороченная форма

норма

физически нормальны, гистологические аномалии мышц

TgUFrn; mdx

точковые мутации в Dmd + трансген Utrn

укороченная форма

норма +

укороченная форма в скелетных мышца

физически нормальны, коррекция гистологических аномалий мышц

Шгп -/-

«нокаут» Utrn

норма

отсутствие экспрессии

физически нормальны, небольшие постсинаптические аномалии в нейромышечных соединениях

Utrn -/-;

mdx

точковые мутации в Dmd +

«нокаут»

Utrn

укороченная форма

отсутствие экспрессии

тяжелая форма миодистрофии с контрактурамисуставов, задержкой роста, кифозом и преж­

девременной

смертью

Tg utrn; Utrn(-/-);

mdx

точковые мутации в Dmd +

«нокаут» Utrn + трансген

Utrn

укороченная форма

отсутствие экспрессии + укороченная форма в скелетных

мышца

физически

нормальны, значительная коррекция миодистрофии и сопут твующих симптомов,

небольшие нейромышечные дефекты

Мы уже подчеркивали критическую роль дистрогликанов в поддержании всего дистрофин-ассоциированного комплекса белков. Трансгенные мыши, гомозиготные по нулевым аллелям дистогликанового гена (Dag1neo2), погибают в раннем эмбриогенезе в результате грубых пороков разви­

тия, возникающих вследствие разрушения Рейхеротовской мембраны. У таких эмбрионов нарушена локализация двух критических структурных элементов этой оболочки — ламинина и коллагена IV.

Недавно были получены химерные мыши с недостаточностью дистрогликанов, путем инъекции в бластоцисты эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), в которых предварительно в условиях культивирования были направленно разрушены оба аллеля гена Dag1 (Cote et al., 1999). У таких мышей развивается прогрессирующая патология мышц, имеющая большое сходство с тяжелой миодистрофией человека. У них наблюдается выраженный кифосколиоз и деформация конечностей при нормальном развитии костной системы. В большинстве мышечных волокон химерных мышей дистрофин-ассоциированный комплекс белков полностью отсутствует и не наблюдается иммуноокрашивания на а-дистрогликан, дистрофин или а-саркогликан. Удивительным оказалось то, что при этом сохраняется ультраструктура базальных мембран мышц с правильной локализацией в них ламинина. Фенотип химерных мышей во многих отношениях напоминает фенотип двойных мутантов по дистрофину и утрофину. Однако, в отличие эт мышей линии (Utrn-/-; mdx), у химерных животных оказа1ись разрушены многие нейромышечные соединения. Это эще раз доказывает ведущую роль в развитии синаптичес:ой системы р-дистрогликана и, возможно, р2-синтрофина,

1рисутствующих у двойных мутантов по дистрофину и утро-

Ьину и отсутствующих у химерных животных. По-видимому, истрогликаны совершенно необходимы для выживания мыючных волокон, дифференцировки нейромышечных соедиений и синаптогенеза, но не являются обязательными для юрмирования базальных мембран мышц.

С использованием методов трансгенного моделирования исследовали роль нейрональной синтетазы окиси азота (nNOS) в патогенезе миодистрофии Дюшенна. При отсутствии дистрофина у больных, также как и у mdx-мышей, nNOS, соединенная в норме с сарколеммой через комплекс дистрофин-гликопротеиновых белков, занимает неправильное положение внутри мышечного волокна, где она продолжает продуцировать окись азота. Было высказано предположение, что одним из элементов сложного патогенетического пути при миодистрофии Дюшенна является токсичность свободных радикалов, обусловленная неправильной цитозольной локализацией nNOS. Однако это предположение не нашло подтверждения, так как у трансгенных mdx-мышей с инактивированным геном nNOS (nNOS-дистрофин нулевые мутанты) сохраняются основные патологические характеристики mdx мышей (Crosbie et al., 1998).

В заключение хотелось бы упоминуть об очень перспективных экспериментах по медикаментозной коррекции аномалий мышц в линии мышей mdx (Barton-Davis et al., 1999). Мы уже упоминали о том, что причиной развития дистрофического процесса у этих животных является нонсенс-мутация в гене Dmd. Оказалось, что в присутствии антибиотика гентамицина может происходить ошибочное проскакивание стоп-кодона при трансляции белков. По-видимому, введение определенных доз этого препарата в развивающиеся мышцы мутантных животных может в каком-то проценте случаев приводить к проскакиванию нонсенс-мутации в гене Dmd и продолжению синтеза белка с образованием функционального дистрофина. Напомним, что нонсенс-мутации в гене DMD являются частой причиной развития миодистрофии Дюшенна и возможность гентамициновой терапии подобных случаев заболевания представляется очень заманчивой. По-видимому, в самое ближайшее время будут начаты клинические испытания возможности такого лечения не только в отношении миодистрофии Дюшенна, но и, возможно, других моногенных заболеваний, обусловленных ошибочным образозованием стоп-кодонов и преждевременным прекращением трансляции соответствующих белков.

10. Генотерапия миодистрофии Дюшенна/Беккера

В последние годы большое внимание уделяется разработке методов генотерапии миодистрофии Дюшенна. Эти исследования пока не достигли стадии клинических испытаний. Они проводятся на мутантных культурах клеток и модельных линиях экспериментальных животных, в первую очередь на линиях мышей mdx, а также на одной из линий охотничьих собак (золотых ретриверов), у которых также обнаружена мутация в гене дистрофина. При этом были опробованы различные способы введения генетического материала, включая перенос миобластов, использование ретровирусных и аденовирусных векторов, а также прямую инъекцию плазмидной ДНК в мышцы.

Успешный перенос гена дистрофина в составе ретровирусного вектора выполнен на культуре клеток млекопитающих (Dickson et al., 1991). Наиболее перспективными для переноса 14кб кДНК дистрофина, по-видимому, являются аденовирусные мини-хромосомы, сочетающие в себе элементы плазмидной ДНК, аденовирусные сигналы начала репликации и сигналы упаковки, а также содержащие р-галактозидазный ген-репортер и регуляторные элементы полноразмерного гена дистрофина (Kumar-Singh, Chamberlain, 1996). В серии экспериментов на mdx-мышах доказана принципиальная возможность генокоррекции миодистрофии Дюшенна (Acsadi et al., 1991). Появление дистрофина человека в сарколемме мышечных волокон mdx-мышей наблюдали после введения ретровирусных или аденовирусных генно-инженерных конструкций, содержащих полноразмерную кДНК гена

дистрофина (14 кб) или его делетированную, но функционально активную форму, так называемый мини-ген размером

6.3 кб (Wells etal., 1992; Сох et al., 1993а; Acsadi et al., 1991; 1995). Мини-ген был сконструирован на базе кДНК пациента с очень мягким течением миодистрофии Беккера, вызванной делецией 46% дистрофина. Эта огромная по протяженности делеция, целиком локализованная внутри стержневого домена, практически не затрагивала функциональной ак­

тивности белка (England et al., 1990). После внутривенного введения фрагментов гена Dmd в составе рекомбинантного аденовируса наблюдали длительное присутствие экзогенной ДНК в скелетных и сердечной мышцах животных (SratafordPerricaudet etal., 1992). Повышение экспрессии дистрофина, происходящее у mdx-мышей в результате трансгеноза полноразмерного гена Dmd, предотвращает развитие аномальных механических свойств мышц диафрагмы, связанных с их дистрофией (Сох et al., 1993а). При этом 50-кратное увеличение уровня экспрессии дистрофина не вызывало никаких побочных токсических эффектов.

Несмотря на эти очевидные успехи, проблема генноинженерной коррекции миодистрофии Дюшенна еще далека от своего решения. До сих пор ведутся оживленные дебаты исследователей о перспективности генной терапии миодистрофии Дюшенна по сравнению с клеточной терапией — пересадкой здоровых эмбриональных миобластов. Пока не утверждена ни одна программа клинических испытаний генотерапевтического лечения миодистрофии Дюшенна. Основные проблемы генокоррекции данного наследственного заболевания связаны с (1) огромным количеством дистрофинположительных мышечных клеток, (2) сложным характером регуляции экспрессии DMD гена, (3) необходимостью обеспечения системы эффективной доставки гена дистрофина в миофибриллы не только скелетных мышц, но, что особенно важно, в мышцы сердца и диафрагмы, а возможно, и в различные отделы мозга, а также (4) с иммунологическими осложнениями, возникающими при использовании вирусных векторов. В связи с этим наряду с совершенствованием прямых, вирус-опосредованных и липосомных способов введения чужеродных ДНК разрабатываются иные подходы к генокоррекции миодистрофии Дюшенна, такие как: использование макрофагов, нагруженных плазмидами; модификация

6 Заказ № 170

культивированных сателлитных клеток, полученных с единичных мышечных волокон; совместное выращивание фибробластов и миобластов, их модификация и генетическая трансформация фибробластов в миобласты; конструирование мини-хромосом, при котором ген дистрофина в составе YACвектора вводится в сферобласты и проводится инфузия этой конструкции в культивируемые миобласты.

Один из подходов в генотерапии миодистрофии Дюшенна основан на трансфекции в мышечные клетки антисмыс-

ловых РНК с целью посттрансляционной коррекции сдвига рамки считывания (Matsuo, 1996). Эта технология основана на том наблюдении, что делеции в гене DMD у пациентов с мягкими формами миодистрофии Беккера, как правило, не сопровождаются сдвигом рамки считывания. В опытах in vitro показано, что в сарколемме культивируемых миотубул mdxмышей появляется экспрессия дистрофина после трансфекции в них олигонуклеотидов, комплементарных З’-сайту сплайсинга 22 интрона гена Dmd (Dunckley et al., 1998). Путем прямого секвенирования соответствующих последовательностей кДНК, полученных из этих клеток методом обратной ПЦР (RTPCR), показано, что при сплайсинге происходит точное вырезание области, включающей мутантный сайт и заключенной между 22 и 30 экзонами. При этом образуется новый РНК-транскрипт дистрофина, который может кодировать продукт, достаточно функциональный для предотвращения развития наиболее тяжелых проявлений миодистрофии.

В 1995 г. исследования по генотерапии миодистрофии Дюшенна начаты в рамках программы «Геном человека» и в нашей стране. С использованием метода бомбардировки клеток и тканей конъюгированными с плазмидами частицами золота или вольфрама, разогнанными до высоких скоростей, полноразмерная кДНК дистрофинового гена была успешно трансфецирована в скелетные мышцы мышей линии mdx (Zelenin et al., 1997). Иммуногистохимический анализ показал, что в некоторых клетках мышц мутантных животных появляется дистрофин (рис. 10). Доля дистрофин-положительных волокон в области бомбардировки поднимается при этом до 2.5-5% (по сравнению с 0.5% в контроле) и сохраняется на этом уровне, по крайней мере, в течение двух месяцев. В некоторых экспериментах доля цельнокрашенных дистрофинположительных волокон в скелетных мышцах увеличивалась от 27% через 2—3 недели до 82% через 2 месяца после баллистической трансфекции (Михайлов и др., 1998). По-видимому, в некоторых случаях происходит нерегулируемая экспрессия трансфецированного гена. Однако экспрессия дистрофина не нормализует полностью дифференцировку волокон. Большой процент цельнокрашенных миофибрилл дегенерирует, в других сохраняется центральное положение ядер.

Рис. 10. Иммуногистохимический анализ дистрофина в мышечных клетках мышей линии mdx до (а) и после (б) введения кДНК-овых конструкций гена DMD

В отличие от липосомного способа введения, еще более успешной оказалась трансфекция полноразмерной кДНК дистрофина (pHSADy) с помощью синтетических микросфер MF-2 (Баранов и др., 1998; Baranov et al., 1998). После однократной инъекции MF-2/pHSADy в четырехглавую мышцу бе­

дра введенная конструкция обнаруживается методом ПЦР во многих тканях, включая скелетные мышцы, сердце, мозг,

легкие, причем присутствие нагруженных плазмидой микросфер определяется методом флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) в 60—70% ядер. Неожиданно высоким оказывается уровень дистрофин-положительных волокон в контра-

латеральной по отношению к инъецированной четырехглавой мышце mdx-мышей спустя 60 дней после введения (рис. 11).

              Рис. 11.     Число дистрофин-положительных волокон

Многие проблемы в генотерапии миодистрофии Дюшенна могли бы быть преодолены при использовании принципиально иного метода коррекции генного дефекта, основанного на специфической активации у больных аутосомного гомолога DMD — гена UTRN (Tinsley, Davies 1993; Blake et al., 1996). Сходная ртратегия изменения регуляции экспрессии фетального гемоглобина была использована для компенсации дефекта глобиновых цепей у больных с серповидно-кле­

точной анемией (Perrine et al., 1993). Характер экспрессии утрофина в раннем эмбриогенезе позволяет предполагать, что этот белок может функционировать как фетальная изоформа дистрофина. Возможно при этом, что утрофин окажется способен заменить дистрофин, если удастся изменить характер экспрессии UTRN-гена у пациентов в тех клетках, в которых в норме ген DMD экспрессируется. Для направленного изменения регуляции работы гена утрофина с помощью определенных химических стимуляторов необходимо прежде всего детальное знание его промоторной области. Реалистичность такого подхода для лечения миодистрофии Дюшенна проверяется в настоящее время в опытах по трансгенозу на модельных объектах, в первую очередь, на mdx-мышах. Мы уже упоминали о том, что при трансгенном введении конструкции, обеспечивающей экспрессию в скелетных мышцах укороченной формы утрофина, в линию дистрофин/утрофиндефицитных мышей, наиболее полно фенокопирующую миодистрофию Дюшенна, наблюдается коррекция основных клинических симптомов миодистрофии (Rafael et al., 1998). Очевидно, что присутствие укороченной формы утрофина в сарколемме мышц мутантных животных, не имеющих эндогенного дистрофина и утрофина, способно восстановить дистрофин-ассоциированный комплекс белков, нормальное развитие и функционирование дефектных мышц. Значение этих результатов для разработки программ генотерапии миодистрофии Дюшенна трудно переоценить.

б) Мышечная дистрофия врожденная

прогрессирующая с умственной отсталостью, тип

Фукуяма (MIM: 253800)

В 1960 г. впервые Фукуяма описал 6 семей с врожденной прогрессирующей миодистрофией дюшенновского типа, сочетающейся с выраженной умственной отсталостью (Fukujama et al., 1960). Характер наследования этой формы миодистрофии соответствовал аутосомно-рецессивному. Представлены результаты клинико-генеалогического анализа более 200 семей с этим заболеванием в Японии (Fukujama et al., 1981). Прогрессирующей мышечной слабости часто сопутствуют мышечная гипотония, эпилептиформные припадки, гидроцефалия. Патоморфологически обнаруживаются микрополигирия, фиброглиальная пролиферация мягкой и паутинной оболочек. Кроме миодистрофии типа Фукуяма известны три клинически различающихся синдрома, при которых врожденная миопатия сочетается с пороками развития, такими как лиссэнцефалия, гидроцефалия, аномалии глаз. Это синдром Валькера-Варбурга (гидроцефалия, агирия, дисплазия сетчатки: HARD-синдром, MIM 236670), описанная в Финляндии болезнь МЕВ (muscle-eye-brain disease, MIM 253280) и врожденная мышечная дистрофия с центральной гипомиелинизацией, обусловленная дефектом мерозина (см. ниже, MIM 156225).

При иммуногистохимическом анализе биоптатов мышц больных с миодистрофией Фукуяма примерно в 13% случаев обнаруживаются аномалии дистрофина (Beggs et al., 1992). Для объяснения этого было высказано предположение, что дистрофин и продукт гена FCMD (Fukujama type congenital muscular dystrophy) взаимодействуют. Раннее начало и более тяжелое течение заболевания наблюдается у пациентов, которые одновременно гетерозиготны по FCMD и гемизиготны по мутациям DMD-гена. Предполагается, что такой комбинированный фенотип встречается среди мужчин в Японии с частотой 1:175000.

У пациентов с миодистрофией Фукуяма обнаруживается аномально низкий уровень экспрессии многих белков дистрофин-ассоциированного комплекса, включая дистрогликаны — трансмембранный 43DAG и экстраклеточный 156DAG, и саркогликаны (Matsumura et al., 1993). Кроме того, содер­

жание ламинина в скелетных мышцах и в периферических нервах пациентов также оказывается сниженным. Однако генетический анализ семей дает основания предполагать, что эти нарушения являются вторичными по отношению к основному биохимическому дефекту, так как найдено сцепление гена FCMD с микросателлитными маркерами, локализованными в области 9q31 -q33 (Toda et al., 1993). Ближайшие фланкирующие маркеры D9S58, D9S59 и D9S2107. Не исключено, что в этой области локализован ген, кодирующий еще один белок дистрофин-ассоциированного комплекса (DAP), дисфункция которого обусловливает клинику миодистрофии Фукуяма. Перекрывание клинических симптомов при миодистрофии Фукуяма и при мягких формах синдрома ВалькераВарбурга и результаты анализа гаплотипов больных по маркерам, сцепленным с геном FCMD, не противоречат предпо­

ложению об аллельной природе этих двух заболеваний (Toda et al., 1995).

Дальнейший генетический анализ, выполненный с использованием техники микросателлитного картирования, позволил сузить область локализации гена FCMD до менее чем 100 кб. Кандидатным для FCMD рассматривается в настоящее время расположенный в той же области ген мышечной рецепторной тирозинкиназы — MUSC (muscle specific kinase) (Toda et al., 1996). Впервые гомолог этого гена —

MuSC — был идентифицирован у мышей (Valenzuela et al., 1995). Показано, что MuSC специфическим образом экспрессируется в скелетных мышцах и в нейромышечных соединениях. При разрушении этого гена путем трансгеноза у мышей не формируются нейромышечные синапсы (DeChiara et al., 1996). Предполагается, что кодируемая геном MUSC рецепторная тирозинкиназа является критическим сигналом для агрина, участвующего в активации всех ступеней каскада, ведущего к образованию синапса, включая организацию постсинаптической мембраны, синапс-специфическую транскрипцию и пресинаптическую дифференцировку.

1.3. Конечностно-поясные мышечные дистрофии

Это гетерогенная группа заболеваний с преимущественной локализацией дистрофического процесса в мышцах плечевого и тазового пояса. Выделяют следующие клинические типы: тазобедренный Лейдена-Мёбиуса; лопаточно-бедренный Эрба; поздний аутосомнодоминантный и квадрицепс-миопатию (Вельтищев и др. 1998). Описана также необычная форма аутосомнорецессивной мышечной дистрофии плечевого и тазового пояса в сочетании с буллезным эпидермолизом.

а) Миодистрофия конечностно-поясная аутосомнодоминантная, типы: 1A(MIM:159100); 1В; 1С; аутосомно-рецессивная, типы: 2А (MIM-.253600); 2В (MIM:253601); 2С (MIM:253700); 2D (ОМ1М:600119);

2Е (OMIM:600900); 2F (OMIM: 601400)

Заболевание начинается в юношеском возрасте с

11—20 лет, возможно и более раннее начало. Мышечная слабость, утомляемость равиваются постепенно, поэтому точно определить дебют заболевания не всегда удается. Слабость сочетается с симметричными атрофиями мышц тазового пояса. Больные начинают испытывать затруднения при беге, быстрой ходьбе, прыжках. Ограничение двигательных возможностей начинает выделять их из группы сверстников. Это особенно отчетливо выявляется на занятиях физкультурой в школе. В дальнейшем появляются затруднения при подъеме на лестницу, вставании со стула и особенно с пола. Появляются так называемые вспомогательные движения, меняющие формулу нормального двигательного акта. Начинаясь с тазового пояса и ног, мышечная слабость распространяется на плечевой пояс и туловище. Меняется осанка, опускаются надплечья, появляются «крыловидные» лопатки. Туловище отклоняется назад, усиливается поясничный лордоз, выпячивается живот, появляется «осиная» талия. Больной ходит раскачиваясь из стороны в сторону, с трудом отрывая стопы от пола. Раньше других атрофируются поясничные и ягодичные мышцы, четырехглавая мышца бедра. Псевдогипертрофии, если и бывают, то не столь выраженными, как при форме Дюшенна. Лицевая мускулатура обычно не страдает. Сухожильные и периостальные рефлексы снижаются, а затем полностью исчезают. Снижение рефлексов начинается с коленных, а за­

тем с двуглавых мышц. Дистальные отделы конечностей еще долго сохраняют свои функции. Течение заболевания прогрессирующее, менее злокачественное по сравнению с миодистрофией Дюшенна. Способность к самостоятельному передвижению может сохраняться до 20—30 лет.

1. Общая генетическая характеристика

LGMD — (limb-girdle muscular dystrophy) — гетерогенная группа заболеваний с варьирующей экспрессивностью мутантного гена. В настоящее время идентифицированы три аутосомно-доминантных формы заболевания: LGMD1A — LGMD1C и шесть аутосомно-рецессивных форм: LGMD2A — LGMD2F (Bushby et al., 1995; Van der Kooi et al.,1997; Bashir et al., 1998). Форма 1A связана с геном, расположенным в длинном плече хромосомы 5 в области 5q22.3-31.3 (Speer et al., 1992). Активно обсуждается возможность участия в контроле этого заболевания гена LMNB1, расположенного в той же цитогенетической области и кодирующего один из белков семейства ядерных ламинов — В1. Ген, ответственный за миодистрофию LGMD1B, ассоциированную с кардиологическими дефектами, расположен в длинном плече хромосомы 1 — в области 1q11-q22 (van der Kooi et al., 1997). В этой же области локализован ген LMNA, кодирующий две другие альтернативно сплайсирующиеся изоформы ядерных ламинов А и С. Показано, что ген LMNA дефектен при аутосомно-доминантной форме мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса (Bonne et. AL, 1999).Несмотря на выраженные клинические различия между этими двумя заболеваниями (отсутствие контрактур и преимущественная слабость проксимальных отделов конечностей при обсуждаемой форме конечностно-поясной миодистрофии), не исключена их аллельная природа.Третья аутосомно-доминантная форма миодистрофии плечевого и тазового пояса LGMD1С обусловлена мутациями в гене кавеолина-3 (CAV3), расположенном в области Зр25 (Minetti et al., 1998).

Пациенты с аутосомно-рецессивными формами LGMD2A и LGMD2B имеют мягкий фенотип и часто клинически могут быть отнесены к типу Эрба. Форма 2А связана с мутациями в гене CAPN3, расположенном в длинном плече хромосомы 15. CAPN3 кодирует одну из субъединиц специфической мышечной протеазы — кальпаина-3. Форма 2В оказалась аллельным вариантом миопатии Миоши и обусловлена мутациями в гене DYSF, локализованном в коротком плече

хромосомы 2. Продукт этого гена — дисферлин, являющийся цитоплазматическим белком, способным связываться с эндоили саркоплазматическим ретикулумом, а также с ядерной мембраной. Гены, ответственные за более тяжелые формы аутосомно-рецессивной конечностно-поясной миодистрофии LGMD2C — LGMD2F, кодируют белки саркогликанового дистрофин-ассоциированного субкомплекса: у-, ос-, р- и 6-саркогликаны, соответственно (Roberds et al., 1994; Lim et al., 1995; Bonnemann et al., 1995; Noguchi et al., 1995; Nigro et al., 1996b). При исследовании бразильских семей с аутосомно-рецессивными формами тазово-поясной мышечной дистрофии, в каждой из которых наблюдали не менее 3 пациентов, в 33% семей болезнь была обусловлена мутациями в гене кальпаина 3 (форма 2А), в 33% — в гене дисферлина (форма 2В), в 17% — в гене ос-саркогликана (форма 2D), в 10% семей — в гене усаркогликана (форма 2С) (Passos-Bueno et al., 1996а). Следует подчеркнуть, что дифференциальная диагностика различных генетических форм конечностно-поясных и аутосомнорецессивных дюшенно-подобных форм миодистрофии возможна в настоящее время только на базе молекулярного анализа.

Генетическое разнообразие конечностно-поясных миодистрофии, по-видимому, не ограничивается описанными выше формами. Так, на основании анализа большой финской семьи, в которой одновременно наблюдали больных с двумя различными формами заболевания — тяжелой конечностно-поясной и мягкой дистальной миопатией с поздним началом, высказано предположение, что в первом случае это результат проявления доминантного гена в гомозиготном, а во втором случае — в гетерозиготном состоянии (Udd et al., 1992). Остановимся более подробно на тех формах миодистрофии плечевого и тазо­

вого пояса, для которых гены уже идентифицированы.

2. Конечностно-поясная миодистрофия. аутосомнодоминантная. форма LGMD1C

Мы уже упоминали о том, что форма LGMD1С обусловлена мутациями в гене кавеолина-3 (CAV3), расположенном в коротком плече хромосомы 3 (Minetti et al., 1998). Кавео-

лин-3 или кавеолин М — специфичная для мышц форма семейства белков, являющихся главными компонентами кавеол — присутствующих в большинстве типов клеток субкомпартментов плазматических мембран. Кавеолы являются динамическими структурами, участвующими в выполнении целого ряда функций, включая эндоцитоз и сигнальную транс-

дукцию. Предполагается, что кавеолины (VIP-21) играют структурную роль в образовании неклатриновых везикул, в том числе в образовании кавеоловых мембран, организуя и концентрируя специфические кавеолин-взаимодействующие

липиды и белки на кавеоловых микродоменах.

Подобно дистрофину, кавеолин-3 локализован в сарколемме мышечных волокон. При субклеточном фракционировании кавеолин-3 осаждается вместе с белками дистрофинассоциированного комплекса и иммунопреципитируется дистрофиновыми антителами, что указывает на то, что кавеолин-3 и дистрофии являются частью дискретного комплекса. При анализе гена CAV3 у 82 пациентов с аутосомно-доминантной формой прогрессирующей конечностно-поясной миодистрофей были найдены две миссенс-мутации — G55S и C71W (McNally et al., 1998).

Предполагается, что мутации в гене CAV3 влияют на процесс олигомеризации кавеолина-3 и на взаимодействие с некоторыми кавеолин-ассоциированными сигнальными молекулами, такими как гетеротримерные G-белки, H-Ras, Src-семейство тирозинкиназ, эпидермальный фактор роста R, протеинкиназа С и синтетаза окиси азота (eNOS). В результате нарушается образование кавеол в плазматической мембране мышечных клеток, что и ведет к развитию данной формы конечностно-поясной миодистрофии.

3. Конечностно-поясная миодистрофия. аутосомнореиессивная. форма LGMD2A

При генетическом анализе группы семей французского происхождения с мягкой формой конечностно-поясной миодистрофии было обнаружено сцепление локуса LGMD2A с маркером D15S25, локализованным в проксимальной части длинного плеча хромосомы 15 (Beckmann et al., 1991). Последующая идентифицикация фланкирующих маркеров, расположенных на расстоянии около 7 сМ друг от друга, позволила изолировать YAC-клоны, содержащие LGMD2A-reH, и использовать их для уточнения цитогенетической локализации гена в области 15q15.1-q21.1 методом флюоресцентной гибридизации in situ (Fougerousse et al., 1994). В дальнейшем в этой области был идентифицирован ген CAPN3 (caleain-3), ответственный за развитие данной формы конечностно-поясной миодистрофии (Richard et al., 1995). CAPN3 кодирует большую субъединицу кальций-активируемой нейтральной специфической мышечной протеазы — кальпаина-3. Кодирующая часть гена CAPN3 разделена на 24 экзона, занимающих более 40 кб геномной ДНК. В гене идентифицировано 4 микросателлитных повтора и 14 Alu-последовательностей. CAPN3 специфически экспрессируется в скелетных мышцах с образованием мРНК-транскрипта размером 3.4-3.6 кб.

Обнаружено более двух десятков мутаций в гене CAPN3 у больных с формой 2А миодистрофии плечевого и тазового пояса. Около половины из них приводят к преждевременной терминации трансляции. Миссенс-мутации затрагивают консервативные остатки или аминокислоты, расположенные в функционально значимых участках доменов. Необычным является то, что шесть разных мутаций найдено у пациентов из одной маленькой изолированной инбредной популяции жителей острова Реюньона (LaReunion). Данные генеалогического анализа, свидетельствующие о присутствии в данном случае «эффекта основателя», находятся в противоречии с результатами молекулярного анализа. Это противоречие по­

лучило название парадокса Реюньона. Для его объяснения предложена дигенная модель наследования формы 2А конечностно-поясной миодистрофии, не получившая пока экспериментальных подтверждений.

Кальпаины относятся к семейству внутриклеточных нелизосомных цистеиновых протеаз. Они включают два повсеместно экспрессирующихся белка — типа 1 и 2, два специфических желудочных белка и мышечную форму типа 3. Кальпаины являются гетеродимерами, состоящими из большой субъединицы, кодируемой соответственно генами CAPN1, CAPN2 и CAPN3, соединенной с маленькой субъединицей, общей для всего семейства. Большие субъединицы раз­

делены на 4 домена, один из которых (II) имеет сходство с цистеин-протеазами, содержащими гистидиновые, цистеиновые и аспарагиновые остатки в активных сайтах. Домен IV имеет кальций-связывающие сайты. Кроме того, в кальпаине-3 присутствуют три уникальных района, два из которых содержат сигнал ядерной транслокации. Обнаружение энзиматического, а не структурного дефекта при миодистрофии является неожиданной находкой. Наиболее простым объяснением может быть то, что данная мышечная протеаза участвует в деградации или дестабилизации структурных компонентов цитоскелета, экстраклеточного матрикса или дистрофинового комплекса. Более вероятной кажется возможность участия этого белка в слиянии миобластов. Ядерная локализация кальпаина-3 не исключает его роли в контроле генной экспрессии. Однако все эти гипотезы требуют экспериментальной проверки. Независимо от реальных механизмов патогенного действия мутаций в гене CAPN3, обнаружение дефекта в энзиматическом белке дает основание для оптимизма в плане разработки фармакотерапии для данной формы конечностно-поясной миодистрофии.

4. Конечностно-поясная миодистрофия. аутосомнореиессивная. форма LGMD2B

В ряде семей с клинически сходной конечностно-поясной миодистрофией обнаружено сцепление мутантного гена не с маркерами хромосомы 15, а с короткими полиморфными тандемными повторами, локализованными в области 2р13 короткого плеча хромосомы 2 — D2S134 и D2S136. Это указывает на существование другого гена — LGMD2B, мутации в котором могут приводить к мягкой аутосомно-рецессивной форме заболевания типа 2В (Bashir et al., 1994). В этой же области генома локализован ген MM (Miyoshi myopathy), ответственный за дистальную форму миопатии с аутосомнорецессивным типом наследования, известную как миопатия Миоши. Болезнь дебютирует в ювенильном или молодом возрасте в виде слабости икроножных мышц.

Оказалось, что конечностно-поясная миодистрофия типа 2В и миопатия Миоши являются аллельными заболеваниями, обусловленными мутациями в гене DYSF (dystrophy-

associated fer-1 -like) (Bashir et al., 1998). Продукт этого гена — дисферлин — имеет высокий процент гомологии с белком fer-1 Caenorhabditis elegans, дефектным у мутантов с нарушенным сперматогенезом. Дисферлин — цитоплазматический белок, состоящий из 2080 аминокислот, имеет большой заряженный гидрофильный район и один мембран-связывающий район на С-конце, обеспечивающий возможность его ассоциации с саркоплазматическим ретикулумом (Liu et al., 1998). В цитоплазматическом домене дисферлина идентифицированы последовательности, характерные для белков, взаимодействующих с ядерной мембраной. Кроме того, цитоплазматический компонент этого белка содержит 4 мотива, гомологичные С2 доменам — внутриклеточным белковым модулям, состоящим из 80—130 аминокислотных остатков и участвующим, по-видимому, в связывании кальция и фосфолипидов. Обнаружено 9 мутаций в гене DYSF у пациентов с

дистальными и проксимальными формами конечностно-поясной миодистрофии. 5 из этих мутаций приводят к преждевременной терминации трансляции. Имеется выраженный фенотипический полиморфизм среди больных, несущих одинаковые мутации. Так, описаны семьи, у одних членов которой болезнь протекает по типу миопатии Миоши, тогда как у

других — в виде конечностно-поясной миодистрофии 2В.

Недавно было показано, что описанная более 30 лет тому назад генетическая линия мышей SJL является естественной моделью обсуждаемой формы конечностно-поясной миодистрофии (Bittner et al., 1999). Мыши этой линии обладают повышенной восприимчивостью к индуцируемым аутоиммунным болезням, таким как экспериментальные аутоиммунные энцефалиты (ЕАЕ) и воспалительные болезни мышц. У мутантных животных часто развиваются спонтанные воспалительные миопатии, при этом в мышцах повышена способность к регенерации. На линии SJL на протяжении многих

лет проводился широкий объем экспериментальных исследований, касающихся различных аутоиммунных болезней человека, изучались процессы регенерации и трансплантации мышц.

С использованием набора из 40 микросателлитных маркеров мышиный ген, ответственный за фенотип мутантных животных, был картирован в 6 хромосоме в области, синтенной району локализации гена DYSF человека. Оказалось, что у мутантных животных экспрессия дисферлина в мышцах составляет не более15% по сравнению с нормой. Это послужило основанием для изоляции и клонирования кДНК гомологичного гена мыши — Dysf. При изучении кодирующей области этого гена у мутантных животных была найдена гомозиготная делеция 171 нуклеотида, сопровождающаяся отсутствием протяженного участка четвертого С2 домена в соответствующем белке и нарушением протеолитической стабильности дисферлина. Таким образом, обнаружение в линии SJL мутации, определяющей развитие прогрессирующей дегенеративной болезни мышц, требует пересмотра экспериментальных результатов, полученных на этой генетической ли­

нии животных.

5. Конечностно-поясная миодистрофия. аутосомнорецессивная. формы LGMD2C-2F (саркогликанопатии)

Гены, ответственные за более тяжелые формы аутосомно-рецессивной конечностно-поясной миодистрофии LGMD2C — LGMD2F, кодируют белки саркогликанового дистрофин-ассоциированного субкомплекса: у-, а-, р- и 8-саркогликаны соответственно (Roberds et al., 1994; Lim et al., 1995;

Bonnemann et al., 1995; Noguchi et al., 1995; Nigro et al., 1996b). Все четыре белка имеют ряд общих характеристик. Они Nгликозилированы, содержат короткий внутриклеточный домен, один трансмембранный и большой внеклеточный домены с С-терминальным кластером цистеиновых остатков. В качестве примера на рис. 12 и 13 представлена структура (5и у-саркогликана соответственно с указанием локализации мутаций, идентифицированных у больных с тяжелыми формами аутосомно-рецессивной конечностно-поясной миодистрофии. У всех пациентов с мутациями в любом из саркогликановых генов отсутствует а-саркогликан. Это может быть первичным дефектом при форме 2D или вторичным — при формах 2С, 2Е и 2F. При этом наблюдается корреляция между клиническим фенотипом и степенью сохранности саркогликанового комплекса, определяемой главным образом типом мутационного повреждения. Независимо от формызаболевания у пациентов с тяжелым течением этот комплекс, как правило, полностью разрушен. Ген а-саркогликана (адхалина) — ocSG (обозначаемый также как ADL или SGA или DAG2), картирован в коротком плече хромосомы 17 в области 17р21 (McNally et al., 1994). Мутации в этом гене приводят к первичной адхалинопатии, варьирующей по степени тяжести аутосомно-рецессивной мышечной дистрофии — аллельному варианту конечностно-поясной миодистрофии LGMD2D (Passos-Bueno et al., 1995).

В описанной ранее тунисской семье, так же как и в ряде других случаев, обнаружено сцепление заболевания с маркерами, локализованными в области 13q12 (Ben Othmane et al., 1992; Sewry et al., 1994). В этой области картирован ген усаркогликана, мутации в котором ответственны за развитие тяжелой детской аутосомно-рецессивной мышечной дистрофии — аллельному варианту конечностно-поясной миодистрофии LGMD2C (Noguchi et al., 1995). У ряда пациентов с тяжелым течением заболевания в тунисских, а также в четырех бразильских семьях в гене ySG была обнаружена однотипная мутация — del521-T, сопровождающаяся сдвигом рамки считывания — рис. 13 (Vainzof et al., 1996). У пациентов, гомозиготных по этой мутации, у-саркогликан в биоптатах мышц полностью отсутствует и в различной степени умень-

Рис. 12. Схематическое представление бета-саркогликана с указанием мутаций, идентифицированных у пациентов с формой 2Е конечностно-поясной миодистрофии

шено содержание а- и р-саркогликанов. Интересно отметить, что у трех сибсов в одной из бразильских семей, в отличие от всех других пациентов с данной мутацией, болезнь протека­

ла в очень мягкой форме и наблюдалась корреляции между клиническим фенотипом и сохранением саркогликанового комплекса при полном отсутствии у-саркогликана. При скрининге мутаций в гене ySG у 50 пациентов из США и Италии с

7 Заказ № 170

Рис. 13. Схематическое представление гамма-саркогликана с указанием мутаций,

идентифицированных у пациентов с формой 2С конечностно-поясной       миодистрофии.

тяжелой формой аутосомно-рецессивной миодистрофии были идентифицированы четыре гомозиготные мутации, сопровож­

дающиеся сдвигом рамки считывания (McNally et al., 1996). Одна из них del521-T, другая — инсерция тимидина после

87 нуклеотида, и две оставшиеся мутации — микроделеции, локализованные в З’-конце гена — del801-TG и del793-TG. У пациентов с последними двумя мутациями полностью отсутствует не только а- и у-, но и р-саркогликан. По-видимому, карбокси-терминальный район у-саркогликана имеет важное значение для сохранения стабильности всего саркогликанового комплекса.

У пациентов с тяжелой дюшенно-подобной аутосомнорецессивной миодистрофией из больших неродственных цыганских семей, проживающих в разных странах Западной Европы, в гене ySG обнаруживается однотипная гомозиготная миссенс-мутация — C283Y, затрагивающая консервативный цистеиновый остаток в карбокси-терминальном районе экстраклеточного домена белка — рис. 13 (Piccolo etal., 1996). Для этих больных характерны ранний дебют, повышенный уровень сывороточной креатинкиназы, отсутствие а- и у-саркогликана в мышцах при нормальном уровне дистрофина. У всех гомо- и гетерозиготных носителей данная мутация находится в абсолютном неравновесии по сцеплению с одним из аллелей внутригенного высокополиморфного маркера D13S232. Анализ полиморфизма по фланкирующим маркерам позволил определить гаплотип общего предка, у которого мутация, по-видимому, возникла от 60 до 200 поколений

тому назад. Полученные данные согласуются с предположением о миграции предков цыган из Индии.

Картирован и клонирован ген р-саркогликана — PSG. Он локализован в области 4q12, его кодирующая часть разделена на 6 экзонов — рис. 12. Мутации в этом гене сопровождаются разрушением саркогликанового субкомплекса и реализуются в виде конечностно-поясной миодистрофии формы 2Е (Lim et al., 1995) либо в виде аутосомно-рецессивной дюшенно-подобной миодистрофии (Bonnemann et al., 1995). Первые две мутации в этом гене, одна из которых приводит к сдвигу рамки считывания, а другая к образованию преждевременного стоп-кодона, были идентифицированы в спорадическом случае у девочки с дюшенно-подобной миодистрофией (рис. 12). Одновременно у нескольких неродственных пациентов из Южной Индианы с мягкой формой конечностно-поясной миодистрофии была обнаружена общая миссенс-мутация — Т151R, находящаяся в гомозиготном состоянии. При скрининге мутаций в гене (3SG у 15 неродственных пациентов бразильского происхождения с тяжелым течением конечностно-поясной миодистрофии также были обнаружены четыре мутации в двух семейных и в двух спорадических случаях (Bonnemann et al., 1996). Три из них присутствовали у пациентов в гомозиготном состоянии и только одна сопровождалась сдвигом рамки считывания. Примеча­

тельно, что все три мутации миссенс-типа были локализованы в экзоне 3, кодирующем экстраклеточный домен — рис. 12.

При генетическом анализе негритянских семей бразильского происхождения с тяжелыми формами конечностно-поясной миодистрофии был обнаружен шестой ген, ответственный за аутосомно-рецессивные формы заболевания (Passos-Bueno et al., 1996b). В области 5q33-34 был идентифицирован ген — 8SG, кодирующий новый компонент саркогликанового субкомплекса — 6-саркогликан (Nigro et al., 1996а). Все 8 пациентов из 4 неродственных бразильских семей оказались гомозиготны по однотипной мутации —делеции одного нуклеотида в экзоне 7 — del656C, приводящей к сдвигу рамки считывания (Nigro et al., 1996b). При секвенировании полноразмерной кДНК пациентов никаких других мутаций не было найдено. Таким образом, было

доказано, что именно этот ген ответственен за форму 2F конечностно-поясной миодистрофии.

Интересно подчеркнуть, что мутация в 6-саркогликановом гене, активно экспрессирующемся в сердечной и скелетных мышцах, найдена в хорошо известной линии сирийского хомячка — BI014.6, используемой в качестве генетической модели аутосомно-рецессивной кардиомиопатии. Для животных этой линии характерны прогрессирующие некрозы

миокарда и сердечная недостаточность.

б) Мышечная дистрофия плечевого и тазового пояса с буллезным эпидермолизом (MIM: 226670)

Необычная форма аутосомно-рецессивного буллезного эпидермолиза в сочетании с мышечной дистрофией плечевого и тазового пояса (MD-EBS — muscular dystrophy — epidermolis bullosa simplex). Пузыри появляются в неонатальном периоде, особенно на коже пальцев рук и ног, позднее — на волосистой части головы, лице и туловище. При этом варианте буллезного эпидермолиза кожные трещины расположены очень близко к плазматической мембране базальных кератиноцитов, что затрудняет установление природы дефекта (внутриклеточный? внеклеточный?) путем электронно-микроскопического исследования биопсийного материала. С возрастом развивается дистрофия ногтей. Прогрессирующая мышечная слабость дебютирует в возрасте 1—2 лет. Больные могут доживать до 30—40 лет.

Характер локализации и широкий спектр дефектов, наблюдаемых у больных с буллезным эпидермолизом, сочетающимся с мышечной дистрофией, дали основание предполо­

жить, что первичное биохимическое нарушение при этом заболевании связано с каким-то промежуточным структурным белком, ассоциированным с филаментами. В качестве

такого кандидата был исследован плектин — ассоциированный с промежуточными филаментами большой якорный бе­

лок, соединяющий цитоскелет клетки с мембраной. Плектин является критическим белком для связывания кератиновой филаментной сети с гемидесмосомальными комплексами.

Оказалось, что у исследуемых пациентов в образцах кожи и мышечной ткани полностью отсутствуют иммунореактивные формы плектина (Gache et al., 1996; Smith et al., 1996). Кроме того, у больных отсутствует близкородственный плектину гемидесмосомальный белок HD1, экспрессирующийся в норме также и в Z-дисках скелетных мышц. Изоляция и секвенироваие кДНКовой последовательности гена плектина крысы позволила провести скрининг банка данных экспрессирующихся последовательностей ДНК человека. Одна из таких последовательностей EST 25263 имела 84% гомологии с кДНК плектина крысы. Олигонуклеотидные праймеры, соответствующие этой EST-последовательности, были использованы для скрининга панели монохромосомных, а затем делеционно-транслокационных соматических гибридных клонов. Таким образом, ген плектина человека — PLEC1 (plectin 1) был картирован в длинном плече хромосомы 8 в области 8q24.13-qter. Методами генетического анализа было показано, что во всех исследованных семьях заболевание косегрегирует с полиморфными маркерами этой области. Сходная ПЦР-стратегия была использована для изоляции из библиотеки кератиноцитов человека полноразмерной кДНК, а затем и геномной последовательности гена PLEC1.

У одного из пациентов с описываемой формой мышечной дистрофии удалось идентифицировать гомозиготную дуп­

ликацию 8 нуклеотидов в кодирующей части гена плектина. Эта дупликация приводила к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременного терминирующего кодона. У аналогичных больных из двух других семей были идентифицированы две различные гомозиготные делеции в гене плек­

тина, одна из которых 2719del9 приводит к отсутствию трех аминокислот в консервативной части гена, и другая — 5866С сопровождается сдвигом рамки считывания. Обнаружение у пациентов с буллезным эпидермолизом, сочетающимся с мышечной дистрофией, дупликаций и делеций в кодирующей части гена PLEC1 явилось подтверждением гипотезы о том, что именно этот ген мутантен при данном заболевании (Pulkkinen et al., 1996). Таким образом, потеря экспрессии одного мультифункционального белка, каким является плектин, может одновременно приводить к развитию дефектов в мышечной и кожной тканях.

1.4. Лице-лопаточно-плечевая мышечная дистрофия Ландузи-Дежерина (MIM: 158900)

Первые признаки болезни появляются в 12—20 лет, хотя не исключается возможность более раннего проявления. Данную клиническую форму отличает своеобразная формула поражения мышечной системы. Преимущественно поражается мускулатура лица, плечевого пояса и проксимальных отделов верхних конечностей. Слабость мускулатуры лица проявляется неполным смыканием век, которое можно заметить в начале болезни во время сна. Мимика лица становится бедной лицо приобретает «маскообразный» вид. Больной испытывает затруднения при наморщивании лба, зажмуривании глаз. Из-за слабости круговой мышцы рта и других мимических мышц невозможен свист, надувание щек и другие мимические движения. Особый порядок вовлечения в процесс мускулатуры плечевого пояса приводит к появлению симптома «крыловидных» лопаток. Раньше других поражаются трапециевидные, ромбовидные, грудные и широчайшие мышцы спины. Длительное время сохраняется функция дельтовидных, над- и подкостных мышц, мышц, поднимающих лопатки. Плечевой пояс поражается раньше и более значительно, мускулатура тазового пояса и проксимальных отделов нижних конечностей включается позже. От начала появления слабости плечевого пояса до развития слабости ног может пройти 15—20 лет. На нижних конечностях страдают подвздошные, большие ягодичные, приводящие мышцы бедер. Икроножные мышцы остаются сохранными. Следует подчеркнуть, что нижние конечности вообще могут остаться интактными. Псевдогипертрофии не характерны для этой формы миодистрофии. Течение заболевания относительно благоприятное. Больные долгое время сохраняют способность к самообслуживанию и трудовой деятельности.

Распространенность миодистрофии Ландузи-Дежерина составляет примерно 2:100000, тип наследования — аутосомно-доминантный. По некоторым данным, женщины болеют примерно в три раза чаще мужчин. В ряде бразильских семей с лице-лопаточно-плечевой миодистрофией прослежена антиципация (Zatz et al., 1995).

При генетическом анализе семей с мышечной дистрофией Ландузи-Дежерина было обнаружено сцепление мутантного гена FSHD1 (facioscapulohumeral dystrophy 1) с микросателлитным маркером Mfd22 — локус D4S171 (Wijmenga et al., 1990), а также с гипервариабельным ДНК-зондом рНЗО — локус D4S139 (Upadhyayava et al., 1991), картированными в дистальном конце длинного плеча хромосомы 4 в области 4q35-qter. Локализация гена FSHD1 в районе 4q35 была подтверждена при анализе точек разрыва транслокации (Х;4), обнаруженной у пациента 4 лет со слабостью лицевых мышц (Mathews et al., 1991). Совместные исследования, выполненные несколькими лабораториями на 65 семьях, в которых наблюдали более 500 больных, также подтвердили сцепление гена FSHD1 с ДНК-маркерами области 4q35 (Sarfarazi et al., 1992). При этом все сцепленные ДНК-маркеры оказались локализованы проксимальнее гена FSHD1, за исключением, возможно, D4S139, для которого найдено наиболее тесное сцепление с исследуемым геном. Обнаружение в области локализации мутантного гена большого числа полиморфных ДНК-маркеров позволяет проводить досимптоматическую и пренатальную диагностику лице-лопаточно-плечевой миодистрофии типа IA в семьях высокого риска. Особенно эффективным при этом оказывается анализ микросателлитных полиморфных маркеров D4S139, D4S163, D4S171 и D4S809.

У пациентов часто присутствуют структурные перестройки в дистальной части 4q, легкодиагностируемые мето­

дом блот-гибридизации по Саузерну (Wijmenga et al., 1992). Используемая при этом в качестве зонда ДНК, клонированная в космидном векторе р13Е-11, локализована дистальнее D4S139. Примечательно, что эта ДНК была изолирована в процессе поиска гомеобоксных генов. У нормальных индивидуумов клон гибридизуется с полиморфным EcoR1 фрагментом, размер которого обычно превышает 28 кб. У пациентов чаще обнаруживают более короткие EcoR1 фрагменты, величиной от 14 до 28 кб. Не исключено, что, в отличие от синдрома Мартина-Белл или миотонической дистрофии, обусловленных экспансией тринуклеотидных тандемных повторов, наследственный дефект у этих больных связан с сокращением числа подобных последовательностей, тесно сцепленных или расположенных внутри гена FSHD1. Обсуждается возможность участия гомеобоксного гена или генов в контроле заболевания. До сих пор было известно, что мутации в гомеобоксных генах вызывают врожденные уродства. Если окажется, что лице-лопаточно-плечевая миодистрофия есть результат перестроек в гомеобоксном гене, это будет первый пример фенотипического проявления в позднем онтогенезе гена, участвующего в контроле развития.

В области 4q35 идентифицирован 3.3-кб тандемный повтор D4Z4, тесно сцепленный с геном FSHD1 (Hewitt et al., 1994). Каждая копия этого повтора содержит две гомеобоксные последовательности с внутренними стоп-кодонами и сдвигами рамки считывания и два известных повторяющихся элемента (LSau и hhspm3), связанных с гетерохроматиновыми районами ДНК, часто вовлеченными в контроль «эффекта положения». Показано, что число копий на геном D4Z4подобных повторов заметно увеличилось в эволюционном ряду на протяжении последних 25 миллионов лет. Хотя D4Z4 не является кодирующей последовательностью и не содержит фрагментов гена FSHD1, выявленная корреляция между делециями в этом локусе и болезнью позволяет предполагать участие «эффекта положения» в патогенезе лице-лопаточно-плечевой миодистрофии. Однако этот эффект не прослеживается для единственного пока гена (FRG1), идентифицированного в теломерном районе длинного плеча хромосомы 4 (van Deutekom et al., 1996a).

В области 10q26 также расположен повтор, имеющий высокую степень гомологии cD4Z4. Наличие подобных гомологичных повторов является причиной высокой нестабильности субтеломерных районов длинного плеча хромосом 4 и 10. Так, в датской популяции в 20% случаев обнаруживаются микроперестройки между повторяющимися элементами этих

двух областей (van Deutekom et al., 1996b). Перестройки создают новые рестрикционные сайты, что необходимо учитывать при проведении диагностики заболевания методом анализа длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Микроперестройки между повторяющимися последовательностями областей 4q35 и 10q26 часто обнаруживаются и у пациентов с лице-лопаточно-плечевой миодистрофией. Молекулярный анализ области локализации FSHD1 гена, проведенный у трех пациентов,показал наличие гибридных кластеров 4q35- и 10д26-производных повторяющихся элементов (Lemmers et al., 1998). При популяционном анализе у двух неродственных индивидуумов в теломерной области длинного плеча хромосомы 4 были обнаружены делеции хромосомного сегмента, расположенного проксимальнее повторов и идентифицируемые зондом р13Е-11.Эти делеции не затрагивали локус FSHD. Однако у одного из этих индивидуумов был ребенок с лице-лопаточно-плечевой миодистрофией. Оказалось, что у ребенка произошла экспансия унаследованной от отца делеции в область повторов. Эти данные согласуются с гипотезой о критической роли эффекта положения в этиологии заболевания и о влиянии длины и структуры повторов на экспрессию соседних генов.

Описаны случаи гонадного мозаицизма у пациентов с лице-лопаточно-плечевой миодистрофией (Weiffenbach etal., 1993). В одной из семей диагноз лице-лопаточно-плечевой миодистрофии был поставлен лишь одному из монозиготных близнецов (Tawil et al., 1993). При этом никто из его родственников не был болен, у самого же пациента диагноз был подтвержден на молекулярном уровне после обнаружения

уникальной перестройки в области 4q35. Наиболее вероятное обьяснение этому — возникновение постзиготической мутации в гене FSHD1 после образования близнецовой пары.

У одной из пациенток с четко прослеживаемой наследственной формой заболевания обнаружены аномалии процесса окисления, связанные с дефектом комплекса III элек­

трон-транспортной цепи, кроме того, в печени не выявлялся цитохром b — компонент комплекса III, при наличии типичных пиков для всех других цитохромов (Slipetz et al., 1991). Электронно-микроскопическое исследование печени пациентки показало присутствие большого числа увеличенных митохондрий с паракристаллическими включениями. При этом делеций или других крупных структурных перестроек в митохондриальной ДНК не обнаружено. Остается, однако, неясным, являются ли выявленные аномалии окислительного процесса типичными для лице-лопаточно-плечевой мио­

дистрофии.

Описана доминантно наследуемая лопаточно-плечевая миодистрофия, дебютирующая в возрасте от 12 до 40 лет, при которой не наблюдается поражения мускулатуры лица (MIM 600416). Данные генетического анализа семей с подобной формой миодистрофии с использованием микросателлитных маркеров, тесно сцепленных с геном FSHD1 (включая маркер D4S139), не исключают возможности того, что это заболевание является аллельным вариантом миодистрофии Ландузи-Дежерина (Jardine et al., 1994). И наоборот, в некоторых семьях, клинически отнесенных к лице-лопаточно-плечевой миодистрофии, при молекулярном анализе не удается обнаружить сцепления мутантного гена с маркерами дистального района длинного плеча хромосомы 4 (Gilbert etal., 1993), что может рассматриваться как доказательство генетической гетерогенности заболевания и существования еще одного локуса, мутации в котором могут приводить к сходной клинической картине.

1.5. Миодистрофии, обусловленные дефектами белков ядерной ламины (эмеринопатии)

В отдельную группу заболеваний мы выделили миопатии, обусловленные дефектами белков, ассоциированных с ядерной ламиной. Эти заболевания получили общее название эмеринопатии. Эмерин — белок, ассоциированный с ламинином ядерной мембраны, оказывается дефектным при Х-сцепленной форме мышечной дистрофии с контрактурами

Эмери-Дрейфуса. Более редкая аутосомно-доминантная форма этого заболевания обусловлена дефектами в гене LMNA, кодирующем два белка ядерной ламины — ламин А и С. Эти белки являются продуктами альтернативного сплайсинга гена LMNA, и они активно взаимодействуют с эмерином. Не исключено, что аутосомно-доминантная форма мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса является аллельным вариантом одной из доминантных форм конечностно-поясной миодистрофии -LGMD1B, ген которой картирован в той же области 1q11-q23, где расположен ген LMNA. Активно обсуждается возможность участия гена LMNB1, кодирующего еще один белок семейства ядерных ламинов — В1, в контроле другой аутосомно-доминантной формы конечностно-поясной миодистрофии -LGMD1A, так как оба мутантных гена расположены в одной и той же цитогенетической области 5q23.3-q31.3. Если эти предположения будут подтверждены, то формы 1А и1В аутосомно-доминантной конечностно-поясной миодистрофии также могут быть отнесены к группе эмеринопатий.

а) Мышечная дистрофия с контрактурами, тип Эмери-Дрейфуса, Х-сцепленная (MIM: 310300)

  1. Клиническая характеристика заболевания

Начальные признаки заболевания отмечаются в возрасте 4—5 лет. Поражаются мышцы тазового пояса при интактности дистальных сегментов. Рано развиваются ретракции ахилловых сухожилий (и постцервикальных мышц), а в последующем контрактуры в локтевых суставах. Псевдогипертрофии отсутствуют. Нередко наблюдается кардиомипатия с нарушением сердечной проводимости. Наиболее частая причина летального исхода — остановка сердечной мышцы. Заболевание отличается медленно прогрессирующим течением. Тип наследования: Х-сцепленный рецессивный, хотя описаны редкие случаи аутосомно-доминантного наследования. Клинически эти две генетически различные формы миодистрофии очень сходны.

  1. Картирование и идентификация гена EMD

При семейном генетическом анализе мутантный ген был картирован в дистальной части длинного плеча Х-хромосомы в области Xq28 (Thomas et al., 1986; Yates et al., 1986). В дальнейшем было показано наиболее тесное сцепление EMD (Emery-Dreifuss muscular dystrophy) с генами цветовой слепоты RCP/GCP, что позволило отнести кандидатный ген в теломерный район Xq28. В результате одновременного генотипирования по нескольким маркерам этого района, проведенного в больших семьях с миодистрофией Эмери-Дрейфуса, и с учетом уже опубликованных данных была составлена наиболее вероятная генетическая карта области локализации EMD: DXS52/DXS15 — 2сМ — (RCP/GCP, EMD) — ЗсМ — F8C — 2сМ — DXS115 (Yates et al., 1993). Фрагменты геномной ДНК, полностью перекрывающие район между DXS15 и F8C, были клонированы в дрожжевых, а затем в космидных векторах, что позволило составить физическую карту этой геномной области, составляющей около 2 миллионов пар оснований (Willard et al., 1994). Оказалось, что этот район характеризуется чрезвычайно высокой плотностью генов, расположенных в каждом из участков ДНК размером от 10 до

20 кб. Более 30 различных генов было картировано между DXS15 и F8C (Bione et al., 1993). Обилие кодирующих последовательностей очень затрудняло идентификацию кандидатного гена. Была определена группа генов, которые не только картируются в этой области, но в норме экспрессируются в тканях, дефектных при миодистрофии Эмери-Дрейфуса. Так, для 27 генов, расположенных между DXS15 и F8C, был определен уровень мРНК транскриптов в различных дифференцированных тканях. По результатам этих исследований было отобрано 8 генов, для каждого из которых наблюдалась высокая экспрессия в скелетных мышцах, в сердце и/или в мозге (Bione et al., 1993). Примечательно, что 7 из них были расположены кластером на растоянии около 45 кб от генов цветовой слепоты, то есть в наиболее вероятном районе локализации EMD. Для каждого гена этой группы были секвенированы полноразмерные кДНК и определены открытые рамки считывания. Поиск кандидатного гена осуществляли методом обратной ПЦР (RT-PCR), то есть проводили амплификацию и секвенирование кДНКовых последовательностей, полученных путем обратной транскрипции мРНК больных. мРНК изолировали из лимфобластозных культур клеток, полученных от пяти неродственных мальчиков с Х-сцепленной семейной формой миодистрофии Эмери-Дрейфуса. Во всех этих случаях были обнаружены различные мутации в одном и том же гене — STA (Bione et al., 1994). В двух культурах были идентифицированы внутригенные делеции 2 и 29 пар оснований, в одной — инсерция двух нуклеотидов. Эти три мутации приводили к сдвигу рамки считывания, образованию стоп-кодонов и преждевременной терминации трансляции. Одна из мутаций нарушала сплайсинг первичного РНК-транскрипта и приводила к инсерции в мРНК интронной области размером в 214 пар оснований. Пятая мутация — замена А на G, разрушала инициирующий AUG-кодон. В этом случае трансляция начиналась со следующего AUG в положении 275. В результате продуцировался белок с N-концевой делецией 72 аминокислот. Таким образом, все идентифицированные мутации сопровождались либо полным отсутствием продукта STA-гена, либо отсутствием части этого белка. Полученные результаты доказывают полную идентичность генов EMD и STA.

3. Структура гена STA и типы мутаций

Кодирующая часть гена STA разделена на 6 экзонов, распределенных на площади около 2 кб. По-видимому, STA относится к числу генов домашнего хозяйства (hause-keeping genes), так как он экспрессируется в большом спектре проанализированных тканей на разных стадиях онтогенетического развития. Наивысший уровень экспрессии наблюдается в скелетных мышцах, в сердце и в ряде других тканей, включая толстый кишечник, тестикулы, яичники, поджелудочную железу. Отсутствие при миодистрофии Эмери-Дрейфуса клинических нарушений во многих немышечных тканях с высоким нормальным уровнем экспрессии STA, по-видимому, свидетельствует о возможности тканеспецифической компенсации дефектов белкового продукта этого гена со стороны других функционально сходных белков.

Наиболее частый тип мутаций в гене STA у пациентов с миодистрофией Эмери-Дрейфуса — небольшие внутригенные структурные перестройки. Идентифицированы также и протяженные делеций, включающие целиком ген эмерина (Small et al., 1998). Все описанные к настоящему времени мутации приводят либо к полному отсутствию, либо к образованию укороченного продукта STA-гена вследствие преж­

девременной терминации трансляции. Содержание эмерина у женщин носительниц мутаций в гене STA часто значимо отклоняется от 50%, что свидетельствует о разном уровне экспрессии нормальных и мутантных аллелей (Manilal et al., 1998). Полное секвенирование насыщенного кодирующими последовательностями 219-кб района Xq28 между локусами

цветовой слепоты (RCP/GCP) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6PD) (Chen et al., 1996) позволило расшифровать молекулярный механизм возникновения делеций всего гена STA, идентифицированной у одного из пациентов с мышечной дистрофией Эмери-Дрейфуса (Small et al., 1997). В непосредственной близости от STA со стороны центромеры расположен 26-кб филаминовый ген (FLN1), разделенный на 48 экзонов и кодирующий актин-связывающий белок 280. Фланкируют этот 48-кб FLNI/STA-район два больших инвертированных повтора размером 11.3 кб. Уровень гомологии между этими повторами превосходит 99%. Оказалось, что причиной возникновения делеций является ошибочное спаривание между большими инвертированными повторами с последующей двойной рекомбинацией между рядом ошибочно спаренных повторов и внутренними последовательностями ДНК. Более частым следствием этих событий является инверсия FLN1/STA области, присутствующая в гетерозиготном состоянии у 33% женщин. Внутрихроматидная рекомбинация вследствие неправильного спаривания двух инвертированных повторов служит причиной возникновения частых инверсий, зарегистрированных также при тяжелых формах гемофилии А и синдрома Хантера (Lakich et al., 1993;

Lagerstedt et al., 1997).

4. Структура и функции эмерина

Ген STA кодирует серин-богатый белок, состоящий из 254 аминокислот, для которого не найдено гомологов среди других белков с известными функциями. Так как это новый белок, авторы предложили называть его эмерином. Два района эмерина — 39 аминокислот на N-конце и 34 — на С-конце, обнаруживают сходство ( 4 1 % гомологии) с белками неизвестной функции — тимопоиетинами, что, в свою очередь, обусловливает и некоторые его структурные особенности. Кроме того, обнаружено сходство по аминокислотной последовательности эмерина с ядерным ламина-ассоциированным белком — LAP2 (Furukawa et al., 1995). В целом белок гидрофильный, но имеет на С-конце гидрофобный домен достаточной протяженности, чтобы служить в качестве мембранного якоря. В эмерине присутствует большое количество сайтов фосфорилирования и только один возможный сайт N-гликозилирования. Сигнального пептида не обнаружено. Идентифицирована так­

же и RGD-последовательность (аргинил-глицил-аспартил — мотив клеточной адгезии), важная для взаимодействий между белками внеклеточного матрикса. По-видимому, эмерин может быть мембранным белком с коротким отрицательно заряженным С-хвостом и большим N-терминальным цитозольным доменом. Подобные белки, способные заякореваться хвостовой частью на мембранах, обнаружены в различных клеточных компартментах. В том числе большое количество таких белков (синаптобревин, синтаксины) присутствует в органеллах секреторного пути, вовлеченного в транспорт везикул. При биохимическом фракционировании показано полное отсутствие эмерина в рас­

творимых фракциях. Это согласуется с предположением о том, что эмерин является одним из членов семейства ядерных мембранных ламина-ассоциированных белков (LAPs). На рис. 14 схематически представлена организация эмерина и тимопоэтинов на ядерной мембране. Показано, что эмерин ассоциирован с внутренней мембраной ядер и эта связь осуществляется посредством С-терминального гидрофобного домена (Cartegni et al., 1997).

Рис. 14. Организация эмерина и тимопоэтинов на ядерной мембране

Большой фрагмент кДНК гена STA был введен в экспрессионную систему Е. coli, и продукт этой конструкции был использован в качестве иммуногена для получения панели из 12 моноклональных антител, реагирующих по крайней мере с 4 различными антигенными детерминантами гидрофильного района эмерина (Manilal et al., 1996). Во всех исследованных тканях все варианты антител идентифицировали один и тот же 34-кД белок, локализованный по краям ядер. В био-

8 Заказ № 170

птатах мышц пациентов с мышечной дистрофией Эмери-Дрейфуса этот белок не мог быть обнаружен ни методами иммуногистохимии, включая иммунофлюоресцентную микроскопию, ни с использованием метода Вестерн блот-гибридизации. Таким образом, при наличии соответствующих антител иммунологические методы могут быть использованы в качестве наиболее простых диагностических тестов

для данного заболевания. В сердце и в культивируемых кардиомиоцитах эмерин обнаруживается также в интеркаляр-

ных дисках.

5. Лопаточно-перонеальные синдромы (SP- синдромы)

Нередко пациентам с доброкачественным течением миодистрофии ошибочно ставится диагноз лопаточно-перонеального синдрома или плече-перонеальной миопатии. Это гетерогенная группа аутосомно-доминантных нейро-мышечных заболеваний, характеризующихся слабостью мышц плечевого пояса и перонеальной мускулатуры. Клинически вы­

деляют две формы — нейрогенную (лопаточно-перонеальная спинальная мышечная атрофия MIM: 181405, ген SPSMA) и первично мышечную (лопаточно-перонеальная мышечная

дистрофия MIM: 181430, ген SPMD). Локус SPMD картирован в длинном плече хромосомы 12 (Wilhelmsen et al., 1996). При генетическом анализе большой семьи с аутосомно-доминантной нейрогенной формой лопаточно-перонеального синдрома ген SPSMA был картирован в области 12q24.1q24.31, примерно на 20 сМ ближе к теломере по сравнению с локусом SPMD (Isozumi etal., 1996). Определен 19-сМ интервал наиболее вероятной локализации гена между маркерами D12S338 и D12S366, что является предпосылкой для идентификации гена SPSMA методами позиционного клонирования. Антиципация по дебюту и тяжести течения заболевания, наблюдаемая в исследуемой родословной, дает основания предполагать возможное участие динамических мутаций в генетическом контроле данного состояния. В непосредственной близости от области локализации гена SPSMA картирован ген SCA2, ответственный за одну из форм спиноцеребеллярной атаксии, обусловленной экспансией внутригенного CAG-повтора. В области поиска SPSMA локализованы следующие гены: NOS1, продуктом которого является нейротрансмиттер, участвующий в образовании окиси азота и играющий важную роль в морфо- и синаптогенезе нервной системы; АТР5В, кодирующий АТФ-синтазу; АТР2А2/ АТР2В, кодирующий Са2+-зависимую АТФазу; MYL2, кодирующий легкую цепь 2 миозина. Эти гены рассматриваются в качестве кандидатных для SPSMA.

Верификация диагноза миодистрофии Эмери-Дрейфуса в сомнительных случаях может быть достигнута только при использовании иммунологических или молекулярно-генетических методов исследования. Однако необходимо иметь в виду, что в ряде семей заболевание наследуется по аутосомно-рецессивному типу и не связано с дефектами эмерина. Так, при полном секвенировании гена STA, выполненном у пациентов из 17 семей с миодистрофией Эмери-Дрейфуса, мутации не были обнаружены в трех семьях (Manilal et al., 1998). При этом уровень эмерина у больных, принадлежащих этим семьям, соответствовал норме.

б) Скапуло-илио-перонеальная атрофия с

кардиопатией (MIM: 181350)

Аутосомно-доминантная миодистрофия Эмери-Дрейфуса или скапуло-илио-перонеальная атрофия с кардиопатией клинически не отличается от Х-сцепленной формы заболевания. При генетическом анализе, выполненном с использованием 280 высокоинформативных микросателлитных маркеров в большой французской семье, насчитывающей 54 индивидуума, 17 из которых были больными, удалось картировать мутантный ген EDMD-AD (Emery-Dreifuss muscular dystrophy — autosomal dominant) в области 1q11-q23 в 8-cM интервале между маркерами D1S2346 и D1S2125 (Bonne et al., 1999). Анализ гаплотипов по микросателлитным маркерам этого интервала, проведенный в четырех других семьях с подобной формой миодистрофии Эмери-Дрейфуса, подтвердил генетическую однородность исследуемой выборки больных.

Локализованный ранее в области 1q21.2-q21.3 ген

LMNA, кодирующий белки ядерной ламины — ламин А и С, был исследован в качестве кандидатного гена для EDMD-AD. С использованием методов прямого секвенирования двух амплифицированных экзонов (1 и 7) и SSCP-анализа остальных 10 экзонов были идентифицированы точечные мутации в гене LMNA у пациентов всех пяти отобранных семей, причем эти мутации отсутствовали у их здоровых родственников. Одна из этих мутаций создавала преждевременный стоп-кодон, три другие сопровождались заменой консервативных аминокислот. При этом одна из миссенс-мутаций — R527P — независимо встретилась в двух неродственных семьях. Таким образом была доказана идентичность генов LMNA и EDMD-AD.

Ламины А и С, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга первичного РНК-транскрипта гена LMNA, относятся к семейству промежуточных филамент, присутствующих в клетках на стадии конечной дифференцировки. Они формируют часть ядерной ламины — фиброзный слой на нуклеоплазменной стороне внутренней ядерной мембраны, служащей каркасом для ядерной обо­

лочки. Ламины имеют стержневой домен, участвующий в образованиии димеров,и карбокси-терминальный глобулярный домен.Они взаимодействуют с хроматином и интегральными белками внутренней ядерной мембраны, в том числе с эмерином. При иммуногистохимическом анализе биоптатов сердечной мышцы было показано, что локализация ламина. А/С и эмерина у больных в исследуемых семьях не изменена. По-видимому, идентифицированные мутации в гене LMNA не приводят к серьезным нарушениям структуры ядерной оболочки, но изменяют ее функции.

Ранее при генетическом анализе, выполненном в трех семьях с аутосомно-доминантной конечностно-поясной миодистрофией, ассоциированной с кардиопатией (LGMD1B), мутантный ген был картирован в той же области 1q11-q22, где расположен ген LMNA (van der Kooi et al., 1997). Несмотря на значительные клинические отличия конечностно-поясной миодистрофии 1В от аутосомно-доминантной миодистрофии Эмери-Дрейфуса, выражающиеся в отсутствии контрактур и гипертрофии икроножных мышц, а также в преимущественной слабости проксимальных отделов конечностей, не исключена аллельная природа этих заболеваний и возможность участия в патогенезе LGMD1B каких-то иных специфических мутаций в гене LMNA. Возможно также, что еще одна форма аутосомно-доминантной конечностно-поясной миодистрофии- 1А-связана с мутациями в гене LMNB1, ко­

дирующим другой компонент ядерной ламины — ламин В1, так как мутантный ген LGMD1А картируется в той же области

5q22.3-31.3 длинного плеча хромосомы 5, где расположен ген LMNB1. Конечно, эти предположения требуют экспериментального подтверждения. Однако очевидно, что компоненты ядерной мембраны вносят определенный вклад в патогенез некоторых нейромышечных заболеваний.

1.6. Врожденные непрогрессирующие миопатии

В самостоятельную клиническую группу традиционно выделяют врожденные непрогрессирующие миопатии. Две из них обусловлены дефектами белков базальной ламины. При врожденных миопатиях дефектными, как правило, оказываются гены, экспрессирующиеся в раннем эмбриогенезе и кодирующие белки, участвующие в процессах роста, дифференцировки и пролиферации миобластов. Примерно в половине случаев врожденных аутосомно-рецессивных мышечных дистрофий с ранним дебютом у больных обнаруживается недостаточность по а2-цепи ламинина 2 (мерозина), локализованного в базальной мембране поперечно-полосатых мышц и связанного с цитоскелетом клетки через комплекс дистрофин-ассоциированных белков. В некоторых случаях это снижение является вторичным, как например при миодистрофии Фукуяма. Мутации в гене ламинина 2 приводят к развитию врожденной мерозин-дефицитной миодистрофии, сочетающейся с гипомиелинизацией белого вещества мозга. Еще одна редкая форма непрогрессирующей врожденной миопатии вызвана наследственной недостаточностью рецептора ламинина в мышцах — а7 интегрина (31D.

Мы уже упоминали о том, что патологические процессы при некоторых врожденных миопатиях сопровождаются образованием в клетках гистологически идентифицируемых аномалий. Так, при немалиновой миопатии в мышечных клетках пациентов присутствуют нитеобразные патологические фибриллярные структуры, причиной развития которых является латеральная экспансия Z-дисков. Эта экспансия при различных формах немалиновой миопатии может возникать вследствие нарушений в структуре интегральных белков тонких филамент, таких как небулин и актин, а также других взаимодействующих с ними белков, в первую очередь тропомиозина В. Определенные гистологические аномалии в мышечных клетках характерны также для пациентов с болезнью центрального стержня и с миотубулярной миопатией. В обоих случаях дефектными оказываются белки, участвующие в контроле дифференцировки мышечных волокон. Различные варианты еще одной врожденной миопатии Бетлема обуслов­

лены дефектной структурой микрофибриллярного коллагена VI типа, оказывающего влияние как на процессы дифференцировки миобластов, так и на структурную организацию внеклеточного матрикса.

а) Мышечная дистрофия врожденная мерозиндефицитная (MIM: 156225)

В «классическом» варианте мерозин-дефицитной миопатии клинические проявления ограничиваются только скелетными мышцами без каких-либо симптомов поражения центральной нервной системы, хотя при магнитно-резонансной томографии выявляются изменения в белом веществе мозга, обусловленные гипомиелинизацией (Banker, 1994; Mercuri et al., 1995). Болезнь проявляется в виде мышечной слабости, гипотонии, задержки моторного развития. Дети поздно начинают садиться и ходить, при этом оказываются не способны передвигаться по неровной местности и на большие расстояния без посторонней помощи. В сыворотке крови наблюдается повышенное содержание креатинкиназы. В биоптатах мышц больных отмечаются гистологические аномалии, свидетельствующие об умеренном течении дистрофического процесса.

Ламинин-2 преимущественно локализован в базальной мембране поперечно-полосатых мышц. Он состоит из тяжелой ос2 цепи и двух легких цепей (J1 и у1, кодируемых разными генами. Ламинин-2 экспрессируется достаточно поздно в эмбриогенезе и на более ранних стадиях его функции, повидимому, выполняет ламинин-1. Ламинин-2 является естественным лигандом для а-дистрогликана. Зрелая а-цепь ламинина-2 состоит из 3088 аминокислотных остатков, сигнальный пептид содержит 22 аминокислоты (Vuolteenaho et al., 1994). При некоторых формах врожденных мышечных дистрофий содержание ламинина-2 в скелетных мышцах и в периферических нервах резко снижено. В некоторых случаях это снижение является вторичным.

При исследовании 20 семей с врожденной аутосомнорецессивной миодистрофией, не относящейся к типу Фукуяма, в 13 было обнаружено полное отсутствие ламинина-2 (Hillaire et al., 1994). Последующий генетический анализ, проведенный в этих мерозин-дефицитных семьях, с использованием метода картирования у пациентов областей генома, гомозиготных по высокополиморфным микросателлитным маркерам, показал, что мутантный ген, ответственный за данную форму врожденной миодистрофии, локализован в той же области 6q22, где расположен ген LAMA2 (laminin alpha 2). В дальнейшем локализация гена LAMA2 в области 6q22q23 была подтверждена многими методами, включая метод флюоресцентной гибридизации in situ (Vuolteenaho etal., 1994).

LAMA2 — это очень крупный ген, занимающий 260 кб геномной ДНК. Его кодирующая часть разделена на 64 экзона, два из которых очень маленькие — 6 и 12 п.о. (Zhang et al., 1996). Идентификация специфических мутаций в гене LAMA2 у пациентов явилась окончательным доказательством его причастности к развитию болезни (Helbling-Leclerc et al., 1995; Nissenen et al., 1996; Allamand et al., 1997). Различные мутации в гене LAMA2 могут приводить к разным клиническим формам заболевания от тяжелых, при которых ламинин2 полностью отсутствует, до промежуточных и мягких, при которых наблюдается количественное снижение белка или присутствуют его дефектные варианты. Так, у двух родственных пациентов с мягким течением врожденной мышечной

дистрофии обнаружена сплайсинговая мутация, сопровождающаяся делецией 63 аминокислот в IV домене белка. Этот домен ответственен за формирование глобулярной структуры на коротком плече сс2-цепи ламинина-2, отсутствие которой, по-видимому, сопровождается разрушением ламининовой сети в мышечных мембранах и нарушением связи белка с дистрофин-гликопротеиновым комплексом (Allamand et al., 1997).

При молекулярном обследовании родственников больных с мерозин-дефицитной миодистрофией выявляется достоверное превышение гетерозиготных носителей мутаций в гене LAMA2. Для объяснения наблюдаемого преимущества гетерозигот привлекается гипотеза отбора, происходящего

либо на уровне гамет, либо среди ранних зародышей на доимплантационной стадии развития.

Мутация в гомологичном гене Lama2, кодирующем а2цепь ламинина мышей, описана у животных генетической линии dy2j с мягкими проявлениями мышечной дистрофии (Xu et al., 1994). Эта ЛИНИЯ является одним из аллельных вариантов классической линии мышей с врожденной мышечной дистрофией — dy, впервые описанной почти 40 лет назад. Показано, что молекулярной основой наблюдаемого фенотипа в линии dy2j является нарушение процесса сплайсинга первичного РНК транскрипта Lama2 и трансляция полипептида с делецией в домене VI ламинина-2, не способного, по-видимому, обеспечить достаточную стабильность мышц при раундах сокращения и расслабления.

б) Миопатия врожденная, обусловленная

недостаточностью а 7 интегрина (J1D

Аутосомно-рецессивная непрогрессирующая врожденная миопатия с задержкой моторного развития (самостоятельная ходьба после 2 лет), сочетающаяся с мышечной гипотонией, нередко — кривошеей.

В развитии и функционировании скелетных мышц критическую роль играет базальная ламина мышечных волокон. Рецептором ламинина в мышцах является а 7 субъединица интегрина (31D. Интегрины — семейство гетеродимерных мембранных гликопротеинов, опосредующих широкий спектр межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий. Известно 16 а- и 8 р-цепей интегринов. В свою очередь а-цепи делятся на 2 группы различающиеся по наличию инсерции около 180 аминокислот в экстраклеточном домене.

Для того чтобы проанализировать роль а 7 субъединицы интегрина p1D в патогенезе болезней мышц, прово­

дили иммуногистохимическое исследование биоптатов мышц 117 пациентов с неклассифицированными формами врожденных миопатии. У трех пациентов было обнаружено отсутствие иммунореактивных форм исследуемого белка при нормальном уровне экспрессии а2 ламинина (Mayer et al., 1997). Оказалось, что у всех трех пациентов имеются мутации в кодирующей части гена а7 интегрина |J1 D

— ITGA7 (integrin alpha 7), локализованного в области 12q13 (Wang et al., 1995). Один пациент был компаунд-гетерозиготой по двум сплайсинговым мутациям, одна из которых приводила к инсерции 7 аминокислот в консервативном цистеин-богатом районе белка, другая сопровождалась делецией 98 нуклеотидов. Эта же делеция в компаунде с делецией 1 нуклеотида была обнаружена у другого неродственного больного. У третьего пациента было резко снижено содержание мРНК-транскрипта ITGA7 Таким образом, было доказано, что мутации в гене ITGA7 ответственны за некоторые редкие формы мягких врожденных миопатии.

Получена трансгенная линия мышей с направленно разрушенным геном а7 интегрина — Itga7 Мутантные животные имеют признаки врожденной миопатии, сходной с той, которая наблюдается у пациентов с дефицитом а7 интегрина p1D(Hayashi et al., 1998).

в) Нитчатая (немалиновая) миопатия, тип 1 (MIM: 161800); тип 2 (MIM: 256030)

1. Клиническая характеристика заболевания

Считается, что немалиновая миопатия наиболее часто встречающаяся форма врожденных непрогрессирующих миопатии. Нередко это заболевание диагностируется благодаря ряду дизэмбриогенетических внешних признаков. У больных часто отмечается удлиненный лицевой череп, низко расположенные ушные раковины, готическое небо, гипоплазия нижней челюсти, деформации грудной клетки по типу «куриной» и позвоночника в виде кифосколиоза. Характерна также амимия, обусловленная включением в процесс лицевой мускулатуры. Больные плохо морщат лоб, не полностью смыкают веки, не могут свистеть, надувать щеки. Часто наблюдается носовой оттенок голоса. Мышечная гипотония и мышечная слабость проявляются с первых месяцев жизни и как при любой диффузной мышечной слабости имеет место симптом «запрокидывания» головы при попытке поднять лежащего на спине ребенка за руки. Выражены симптомы «свободных» надплечий, «треножника» и др. Отстают темпы моторного развития. В первые три года возможны повторные пневмонии. Дети начинают ходить с полутора лет, не могут бегать, прыгать. В дальнейшей жизни больные остаются инвалидами, однако способность к самостоятельному передви­

жению сохраняется, что дает возможность приспособиться к самообслуживанию и даже приобрести специальность. Течение заболевания в целом относительно стационарное. Мышечная сила более снижена в проксимальных отделах конечностей, и отчетливо преобладает слабость в руках. Глубокие рефлексы снижены и в течение жизни могут угасать. Разви­

тия сухожильных ретракций, как правило, не отмечается.

Весьма характерны мышечные атрофии.

Немалиновая миопатия получила свое название в связи с особыми нитеобразными структурами, обнаруживаемыми при гистологическом анализе в мышечных клетках больных. Патологический фибриллярный материал сходен с веществом, образующим Z- диски и, возможно, является тропомиозином В. Наряду с тропомиозином В, а-актинин является главным белковым компонентом Z-дисков и немалинового тела, образующегося, по-видимому, в результате латеральной экспансии Z-дисков.

Чаще всего немалиновая миопатия наследуется по аутосомно-рецессивному типу, хотя описаны и доминантные формы заболевания. Оказалось, что не менее трех генов изолированно участвуют в контроле немалиновой миопатии: доминантные формы заболевания связаны с мутациями в гене ос-тропомиозина — ТРМЗ и в гене мышечного а-актина — АСТА1, тогда как типичная непрогрессирующая или медленно прогрессирующая рецессивная форма обусловлена мутациями в гене небулина — NEB (Laing et al., 1995; Pelin et al., 1999; Nowak et al., 1999).

2. Роль а-актинина и ос-тропомиозина в патогенезе немалиновой миопатии

При различных формах немалиновой миопатии часто обнаруживается снижение или отсутствие актин-связанного белка а-актинина в мышечных клетках, тогда как в немышечных клетках пациентов никаких аномалий актина или а-актинина не отмечается (Wallgren-Petersson et al., 1990). Было высказано предположение, что гены мышечного а-актинина — ACTN2 и ACTN3, расположенные в хромосомах 1q42q43 и 11q13-q 14 соответственно, ответственны за некоторые формы немалиновой миопатии. Однако в дальнейшем это предположение не нашло экспериментального подтверждения. Так, с использованием техники микросателлитного картирования было исключено сцепление рецессивной формы заболевания с геном ACTN2 (Tahvanainen et al., 1994). Маловероятно также, что эта форма немалиновой миопатии обус­

ловлена дефектом гена ACTN3. Хотя а-актинин 3 отсутствует при многих формах миопатии, этот дефект не является первичным. При проведении обширного иммуно-скрининга с использованием образцов биоптатов мышц 55 контрольных индивидуумов и 118 пациентов с различными формами нейромышечных заболеваний (среди них 74 пациента с миопатиями и 20 — с нейрогенными болезнями) экспрессии гена ACTN2 у больных не было обнаружено ни в одном случае, тогда как а-актинин 3 отсутствовал в 19% исследованных образцов (North et al., 1999). При этом никакой корреляции между биохимическим дефектом и клиническим фенотипом выявлено не было. Оказалось, что в 96 % случаев отсутствие а-актинина 3 связано с наличием двух высокополиморфных гомозиготных мутаций в гене ACTN3: миссенс-мутации Q523R и нонсенс-мутации R577X. В разных популяциях частота нонсенс-мутации R577X варьирует от 22% до 52%. Выявлено сильное неравновесие по сцеплению между двумя этими мутациями. В подавляющем большинстве случаев в популяциях встречается сочетание либо двух мажорных, либо двух минорных аллелей. Суммарная частота аллелей 523R/ 577R и 523Q/577X составляет всего лишь около 4%.

При семейном генетическом анализе было обнаружено сцепление гена NEM1(nemaline myopathy JJ, ответственного за доминантную форму заболевания, с геном АРОА2, картированным в области 1q21-q23 (Laing et al., 1992). Недалеко от APOA2 в районе 1q23-q24 локализован ген а-субъединицы немышечного тропомиозина — ТРМЗ. У человека идентифицировано 4 гена тропомиозина. Для каждого из этих генов показан альтернативный сплайсинг, сопровождающийся образованием множественных изоформ соответствующих белков. Ген ТРМЗ преимущественно экспрессируется в мышечных волокнах первого типа. Этот ген также был исследован в качестве кандидатного для NEM1. В одной из семей с

доминантно наследуемой немалиновой миопатией у больных была обнаружена миссенс-мутация в гене ТРМЗ, косегрегирующая с заболеванием (Laing et al., 1 9 9 5 ) . Эта мутация сопровождается заменой аминокислоты в актин-связывающем центре немышечного тропомиозина. Полученные данные делают весьма вероятной гипотезу об идентичности генов ТРМЗ и N E M 1 . Эта гипотеза была подтверждена в дальнейшем при обнаружении в гене ТРМЗ гомозиготной нонсенсмутации у пациента с рецессивным типом наследования немалиновой миопатии (Tan et al., 1 9 9 9 ) . Таким образом, мутации в гене а-тропомиозина могут явиться причиной разви­

тия как доминантных, так и рецессивных форм заболевания.

З.Молекулярные основы аутосомно-реиессивной медленно прогрессирующей немалиновой миопатии

В ряде семей с аутосомно-рецессивным типом наследования и типичным течением непрогрессирующей или медленно прогрессирующей немалиновой миопатии, дебютирующей в младенческом возрасте, было обнаружено сцепление мутантного гена N E M 2 с маркерами длинного плеча хромосомы 2. В области 2q21.2-q22 локализован ген небулина — N E B (Zeviani et al., 1 9 8 8 ) . Кодирующая часть гена N E B разделена на 1 8 7 экзонов, распределенных на площади около 4 0 0 кб. Размер кДНК гена N E B составляет 2 0 . 8 кб.

Огромный по своим размерам саркомерный белок небулин, составляющий около 3 — 4 % всего микрофибриллярного белка, является наряду с актином и титином интегральным компонентом тонких филамент поперечно-полосатых мышц (Wang et al., 1 9 9 6 ) . Молекулярная масса небулина варьирует от 6 0 0 до 8 0 0 кД, и полипептид, состоящий из 6 6 9 0 аминокислот, содержит 1 8 5 копий 35-аминокислотных модулей, кодируемых отдельными экзонами гена N E B . 3 T H повторяющиеся модули классифицированы на 7 различных типов. 120-кД карбокси-терминальный район небулина высококонсервативен и гомологичен одному из филаментных белков сердечной мышцы (nebulette). На С-конце небулина располагаются два уникальных домена — серин-богатый, содержа-

щий многочисленные сайты фосфорилирования, и ЭНЗ-домен. Модули М 163-М 176 являются компонентами 1-диска, тогда как М177-М 185 входят в Z-мембрану. Прикрепление небулина к Z-дискам саркомера осуществляется посредством его взаимодействия с ЭНЗ-гомологичной последовательностью. Таким образом, С-терминальный район небулина,

локализованный в I-Z-I диске, участвует в регуляции образования и интеграции Z-мембраны в саркомере. Множество изоформ небулина, образующихся за счет альтернативного сплайсинга гена NEB, определяют молекулярное разнообразие Z-дисков. Особенно интенсивный дифференциальный сплайсинг наблюдается в районе повторяющихся модулей М176 —М182.

Был проведен молекулярный анализ З’-района кДНК гена NEB, включающего экзоны 163—172, в 22 семьях раз­

личного этнического происхождения с рецессивной формой небулиновой миопатии (Pelin et al., 1999). Поиск мутаций осуществляли с использованием методов однонитевого конформационного полиморфизма (SSCP) и обратной ПЦР (RT-PCR). При этом анализе было идентифицировано 6 различных мутаций у больных из 5 семей различного этнического происхождения. Все мутации сопровождались сдвигом рамки считывания и образованием укороченных на 25-80 кД форм небулина. Иммунофлюоресцентный анализ с использованием антител на С-терминальную часть белка показал, что укорочение небулина ведет к потере разнообразия типов волокон и это, по-видимому, является основной причиной развития патологических процессов, ведущих к образованию немалиновых тел.

4. Актиновая миопатия

Относительно недавно были описаны 3 пациента с тяжелой формой врожденной миопатии, в мышечных биоптатах которых наблюдались большие накопления тонких филамент, расположенные под сарколеммой мышечного волокна (Goebrl et al., 1997). Двое из этих пациентов умерли в младенческом возрасте, третий дожил до 7.5 года. Наблюдаемые у пациентов филаментные образования интенсивно окрашивались антителами на актин, и потому заболевание получило название актиновой миопатии. Ген а-актина скелетных мышц — АСТА1, локализованный в области 1q42, был исследован в качестве кандидатного для новой формы миопатии (Nowak et al., 1999). У всех трех пациентов были найдены гетерозиготные миссенс-мутации в кодирующей области гена АСТА1. Поскольку у двух из обследованных пациентов наряду с филаментными образованиями наблюдались немалиновые тела, было высказано предположение, что некоторые тяжелые формы немалиновой миопатии могут быть клиническими вариантами актиновой миопатии. У детей с тяжелыми формами немалиновой миопатии уже при рождении отмечается выраженная гипотония и слабость мышц, недостаток спонтанных движений, затруднения при кормлении и дыхательная недостаточность. Такие дети часто погибают в мла­

денческом или в раннем детском возрасте.

Для проверки выдвинутого предположения был проведен поиск мутаций в гене АСТА1 у 59 больных с различными формами немалиновой миопатии, включая тяжелую (Nowak et al., 1999). В результате у больных из 14 неродственных семей было идентифицировано 15 различных миссенс-мутаций, затрагивающих все 6 кодирующих экзонов гена АСТА1. Во всех этих семьях, за исключением одной, мутации у больных присутствовали в гетерозиготном состоянии, что подтверждает доминантный характер наследования заболевания. В 7 случаях удалось доказать возникновение мутации de novo. В одной из семей с относительно мягким течением заболевания было прослежено рецессивное наследование.У большинства носителей мутаций немалиновая миопатия проявлялась в очень тяжелой форме и приводила к гибели детей в младенческом возрасте (8 семей) или в первом десятиле­

тии жизни (3 семьи). Таким образом, было доказано, что наследуемые по аутосомно-доминантному типу тяжелые формы немалиновой миопатии, а также некоторые рецессивные формы заболевания могут быть обусловлены мутациями в гене а-актина, то есть являются аллельными вариантами ак-

тиновой миопатии.

На рис. 15 схематически изображена модель F-актина, взаимодействующего с миозином. Взаимодействие между Fактином тонких филамент и миозином толстых филамент лежит в основе сокращения и расслабления мышечных волокон. F-актин состоит из 6 отдельных субъединиц актина. В центре комплекса расположен а-актин. Кружками указана локализация аминокислотных замен, идентифицированных у больных с актиновой и немалиновой миопатией. Идентифицированные мутации могут быть разделены на два типа: (1) замещения остатков, расположенных в гидрофобных кластерах или в корах — L94P, M132V, V163L и V370F, и (2) — на поверхности молекулы —G15R, H40Y, N115S,G182D, R183C, R256H, E259V, Q263L, N280K и D286G. Некоторые из этих мутаций, идентифицированные у пациентов с наиболее тяжелыми формами заболевания, локализованы в функционально-значимых сайтах актиновой молекулы. Так, глицин в 15 положении а-актина (G15) принимает участие в образовании водородных связей с (3-фосфатами АТФ и АДФ, аминокислотные остатки G182 и R183 локализованы в сайтах связывания с ДНКазой I, а Н40 и V370 — в сайтах связывания с миозином. Аспарагиновая кислота в 286 положении принимает непосредственное участие во взаимодействиях субъе­

диниц F-актина, и можно предположить, что ее замещение приводит к дестабилизации всего комплекса. Аминокислоты R183 и N280, расположенные на поверхности а-актина, способны формировать ионные взаимодействия с другими частями актина. В этой связи интересно подчеркнуть, что в аналогичных взаимодействиях принимают участие две аминокислоты в актине сердечной мышцы — R312 и Е361 — и каждая из них вовлечена в мутацию при одном из наследственных вариантов дилатационной кардиомиопатии (Olson et al., 1998). Однако, несмотря на очевидную связь между характером мутационного повреждения в гене АСТА1 и тяжестью

 

течения актиновой миопатии, в ряде случаев не удается исключить зависимость фенотипического проявления мутаций от каких-то других факторов как эндогенного, так и экзогенного порядка.

Рис. 15. Модель F:-актина и миозина с указанием локализации аминокислотных замен, идентифицированных у больных с немалиновой миопатией

9 Заказ № 170

Подводя итоги, можно заключить, что молекулярной основой развития патологических процессов и, в частности, образования немалиновых тел при различных формах немалиновой миопатии являются дефекты в структуре небулина, актина и, возможно, других белков тонких филамент, а также взаимодействующих с ними белков, таких как тропомиозин и а-актинин. Подобные дефекты ведут к нарушению физиологического взаимодействия этих белков в Z-дисках, и эти нарушения являются критическими для развития немалиновой миопатии.

г) Болезнь центрального стержня (MIM: 117000)

Заболевание выделено как самостоятельная нозологическая форма из группы врожденных непрогрессирующих миопатии, благодаря своеобразным морфологическим изменениям мышечных волокон, обнаруживаемым в биопатах при специальной окраске с использованием электронной микроскопии. Гистологическим маркером болезни центрального стержня является отсутствие митохондрий на свежезамороженных срезах скелетных мышц в центре многих волокон первого типа. На биохимическом уровне имеет место высвобождение фосфата из глюкозо-6-фосфата. Начальные признаки болезни проявляются в раннем возрасте общей мышечной гипотонией, мышечной слабостью, задержкой темпов моторного развития. Интеллектуальное развитие не страдает. Статус в первые месяцы укладывается в понятие «вялый ребенок». Самостоятельная ходьба начинается с задержкой на 4—6 месяцев и характеризуется неуверенностью и частыми падениями. Мышечная слабость локализуется преимущественно в проксимальных отделах верхних и нижних конечностей. Слабость мышц спины и грудной клетки может способствовать развитию костных деформаций в виде сколиоза позвоночника, воронкообразной или «куриной» грудной клетки. Атрофии мышц выражены умеренно, псевдогипертрофий не бывает. Глубокие рефлексы сохраняются, хотя могут быть в той или иной степени снижены. Сухожильные ретракции отсутствуют. Течение заболевания доброкачественное, отмечены даже улучшения в виде нарастания мышечной силы в юношеском возрасте. Витальный прогноз благоприятный. В ряде семей болезнь центрального стержня сочетается со злокачественной гипертермией — аутосомнодоминантно наследуемой повышенной чувствительностью к анестезии, обусловленной, по-видимому, дефектами в системе окислительного фосфорилирования (Frank et al., 1978). Злокачественная гипертермия, в свою очередь, часто сочетается с доминантно наследуемой миопатией, отличной от болезни центрального стержня.

Семейный анализ сцепления заболевания с различными ДНК-маркерами позволил отнести мутантный ген CCD

(central core disease) в область 19q12-q13.2 (Haan etal., 1990; Kaush et al., 1991). Было высказано предположение, что болезнь центрального стержня обусловлена мутациями в гене рецептора-1 рианодина (RYR1 — ryanodine receptor 1), расположенном в той же области генома (Mulley et al., 1993). Это предположение было подтверждено при обнаружении ряда мутаций в гене RYR1 у пациентов с болезнью центрального стержня (Zhang et al., 1993; Quane et al., 1993). Таким образом была доказана идентичность генов CCD и RYR1.

Рецептор рианодина — кальций-высвобождающий канал саркоплазматического ретикулума скелетных мышц (рис. 16). Рецептор рианодина необходим для развития и созревания мышц, а также его функции связаны с сокращением-расслаблением миофибрилл. Трансгенные мыши с направленно разрушенным геном Ryr1 погибают в перинатальном перио­

де и имеют значительные аномалии в развитии скелетных мышц (Takeshima et al., 1994). ДНК-маркеры RYRI-гена косегерегируют с некоторыми формами злокачественной гипертермии. Оказалось, что около 50% случаев злокачественной гипертермии являются аллельными вариантами болезни центрального стержня и обусловлены различными миссенсмутациями в гене RYR1. Причем одна из этих мутаций — R163C — встречалась у различных неродственных пациентов, как с гипертермией, так и с болезнью центрального стержня, что указывает на возможность участия иных генетических или средовых факторов в формировании подобной клинической гетерогенности (Quane et al., 1993).

Рис. 16. Схема работы рецептора рианоцина

Некоторые пациенты с наследственной гипертрофической кардиомиопатией, обусловленной мутациями в гене тяжелой цепи р-миозина (MYH7), имеют выраженную мышечную слабость и гистологические аномалии, сходные с теми, которые наблюдаются при болезни центрального стержня. У одного из таких пациентов найдена миссенс-мутация — L908V в гене MYH7, что доказывает возможность участия данного гена в контроле некоторых форм болезни центрального стержня (Fananapazir et al., 1993).

д) Миотубулярная миопатия (MIM: 310400)

Данная форма врожденной миопатии отличается особыми образованиями, выявляемыми гистологически и гистохимически. Мышечные волокна в своей центральной части изменены, отличаются повышенной ферментативной активностью и похожи на эмбриональные мышечные клетки. В этом же отделе мышечного волокна обнаруживаются скопления мышечных ядер. Мышечные волокна уменьшены в размерах и отличаются повышенной активностью окислительных ферментов. Клинические проявления отмечаются с первых месяцев жизни в виде диффузной мышечной гипотонии, атрофии и генерализованной слабости мышц. Глубокие рефлексы медленно снижаются. Течение, как правило, медленно прогрессирующее, не исключена и стабилизация процесса. Все это сближает клинические данные с таковыми при других врожденных миопатиях. Однако следует отметить, что заболевание имеет некоторые отличительные черты, способствующие клинической диагностике. К ним можно отнести поражение глазодвигательных мышц, приводящее к косоглазию, и двусторонний, различной выраженности птоз. Миотубулярная миопатия — генетически гетерогенная группа клинически сходных заболеваний.

В разных семьях прослеживается различный характер наследования: аутосомно-доминантный, аутосомно-рецессивный и Х-сцепленный рецессивный. В последнем случае заболевание характеризуется ранним началом и более тяжелым течением. При рождении больного ребенка наблюдается снижение или отсутствие спонтанных движений и нарушение дыхания вследствие задержки или остановки нормального развития мышечных волокон. Болезнь проявляется уже в пренатальном периоде и часто сопровождается многово-

дием и слабым шевелением плода. У облигатных гетерозигот часто наблюдаются выкидыши и мертворождения. большинство пациентов погибают от дыхательной недостаточности в возрасте 4—5 месяцев. Некоторые мальчики доживают до взрослого периода за счет лучшей респирации после рождения. Причины подобной клинической гетерогенности неизвестны.

Описана косегрегация сцепленной с полом миотубулярной миопатии с маркерами области Xq28, в том числе с геном фактора VIII свертывания крови — F8C (Thomas et al., 1987; 1990). Ген МТМ1 (myotubular myopathy 1) локализован проксимальнее F8C (Lehesjoki etal., 1990), ближайшими фланкирующими микросателлитными маркерами являются DXS304 и DXS305 (Dhal et al., 1994). Маркеры DXS455 и DXS1684 наиболее информативны для диагностики аллельного состояния гена МТМ1. Открытию гена сцепленной с полом миотубулярной миопатии способствовало описание пациентов, несущих микроделеции в области локализации этих маркеров (Dhal et al., 1995). Так, обнаружение делеции у девочки с относительно благоприятным течением миотубулярной миопатии позволило ограничить вероятный район лока­

лизации гена МТМ1 600 тысячами пар оснований. Затем при идентификации точек разрыва перекрывающихся микроде­

леции у двух мальчиков, характеризующихся миотубулярной миопатией и аномалиями полового развития, этот район в проксимальной области Xq28 дистальнее маркера DXS304 был сужен до 430 кб (Ни et al., 1996). Полученные результаты ПОЗВОЛИЛИ использовать стратегию позиционного клонирования для изоляции гена МТМ1. Фрагменты ДНК из области перекрывания двух таких микроделеции были клонированы в дрожжевых и космидных векторах (Laporte et al., 1996). Для нахождения транскрибируемых последовательностей в клонированных ДНК использовали три различных подхода: (1) отбор из тканеспецифических библиотек генов кДНКовых последовательностей, гибридизующихся с геномными маркерами, сцепленными с геном МТМ1, (2) улавливание экзонов и (3) частичное секвенирование клонированных геномных последовательностей с последующим компьютерным поиском кодирующих областей. В результате было отобрано пять экзонов и шесть кДНК-клонов, содержащих частично перекрывающиеся фрагменты ДНК. Кроме того, три района секвенированных космидных последовательностей соответствовали кодирующим областям ДНК. При сопоставлении мест лока­

лизации этих элементов был идентифицирован неизвестный ранее ген — CG1, занимающий протяженную центральную часть области перекрывания двух микроделеции. Этот ген состоит из 7 экзонов и преимущественно экспрессируется в скелетных мышцах; размер мРНК составляет 4.6 кб. CG1 рассматривался как наиболее вероятный кандидат для МТМ1.

Однако предположение не нашло подтверждения, так как ни у одного из 28 пациентов с Х-сцепленной миотубулярной миопатией мутаций в кодирующей части гена CG1 обнару­

жено не было. Возможно, этот ген является кандидатным для каких-то других наследственных заболеваний, обусловленных повреждением области Xq28, таких как синдром Вайсмана, Х-сцепленная умственная отсталость (MRX3) или отопалато-дигитальный синдром (OPD).

Второй идентифицированный ген — CG2, состоящий из 15 экзонов, отсутствовал у одного из пациентов с микроделециями и был частично делетирован у другого. Дополнительный скрининг 12 тканеспецифических библиотек и компьютерный анализ базы данных EST-последовательностей позволили идентифицировать фрагмент кДНК размером в 3.4 кб с сигналом полиаденилирования и откры­

той рамкой считывания. Этот фрагмент кДНК способен кодировать полипептидную цепь, состоящую из 621 аминокислоты. Причем в клонах кДНК, изолированных соответственно из библиотеки печени и скелетных мышц, присутствовали альтернативные сайты полиаденилирования. Оказалось, что ген CG2 идентичен МТМ1, так как были обнаружены различные мутантные аллели этого локуса у пациентов с Х-сцепленной миотубулярной миопатией. Наряду с миссенс-мутациями описаны небольшие делеций и инсерции, приводящие к сдвигу рамки считывания. Иссле­

дование 40% кодирующей области гена МТМ1 позволило идентифицировать мутации у 12% пациентов.

Продукт гена CG2, получивший название миотубулярин, имеет высокую гомологию по последовательности с одним из белков Saccharamyces cerevisiae и Caenorhabditis elegans (53% и 56% соответственно). Кроме того, анализ базы данных EST-последовательностей показал, что в геноме человека существует по крайней мере восемь других не описанных ранее генов, высокогомологичных МТМ1. Определена хромосомная локализация и характер экспрессии большинства из них (Laporte et al., 1997). Один из этих генов локализован дистальнее МТМ1 в Xq28. Миотубулярин содержит район (РТР), сходный с активным центром тирозинфосфатаз. Эти белки вовлечены в регуляцию путей сигнальной трансдукции, участвующих в контроле процессов роста, пролиферации и дифференцировки клеток. Оказалось, что миотубулярин способен гидролизовать синтетический аналог тирозинфосфата в реакции in vitro, ингибируемой ортованадатом. По-видимому, миотубулярин является членом нового семейства тирозинфосфатаз (DSP), обладающих двойной специфичностью как по отношению к тирозину, так и по отношению к серину. Дефекты этого белка сопровождаются нарушениями нормального процесса созревания мышц, что и приводит к развитию миотубулярной миопатии. Другие гомологи миотубулярина не имеют функционального РТР-активного сайта. МТМ1 принадлежит к семейству высококонсервативных генов, обнаруженных не только в геноме млекопитающих, но и у различных видов дрожжей, а также у дрозофилы (Laporte et al., 1997). Сравнение этого ряда генов позволяет реконструировать филогенетическое дерево и определять консервативные остатки, наиболее существенные для выполнения общих функций соответствующих белков.

Прямое секвенирование 92% кодирующей части МТМ1 гена у мальчиков с миотубулярной миопатией, диагностированной на основе гистологического анализа биоптатов мышц, позволило идентифицировать 26 мутаций, 50% которых были локализованы в экзонах 4 и 12 (de Gouyon et al., 1997). У большинства пациентов обнаруживаются точковые мутации, 4 из которых нарушают процесс сплайсинга. Одна из миссенс-мутаций затрагивает высококонсервативную аминокислоту, присутствующую во всех гомологичных белках других исследованных видов начиная с дрозофилы. У остальных пациентов найдены делеции размером от нескольких нуклеотидов до 2—6 экзонов. Три мутации встретились более чем у одного пациента. В параллельном исследовании было проведено скринирование всей кодирующей области МТМ1 гена методом SSCP-анализа у 85 неродственных пациентов (Laporte et al., 1997). В 55 случаях удалось идентифицировать мутантные аллели. Большие делеций обнаружены только у трех пациентов. 5 точковых мутаций найдены у многих пациентов и, по-видимому, они обьясняют 27% всех случаев заболевания. Более половины мутаций нарушают ферментативную активность миотубулярина, вследствие преждевременной терминации трансляции либо в результате аминокислотных замен в фосфатазном домене белка. Остальные миссенс-мутации кластерированы в двух консервативных районах миотубулярина, что является указанием на присутствие в этом белке других функциональных доменов, не связанных непосредственно с реакцией фосфорилирования. е) Миопатия Бетлема (MIM: 158810)

Генетически гетерогенная группа врожденных миопатии с аутосомно-доминантным типом наследования. Заболевание характеризуется врожденной мышечной гипотонией, укладывающейся в картину синдрома «вялого ребенка». В последующем наблюдается медленно прогрессирующая атрофия мышц с возможным развитием кардиомиопатий и множественных контрактур суставов (Bethlem, van Wijngaarden, 1976; Arts et al., 1978). В биоптатах мышц наблюдается атрофия волокон I типа.

При генетическом анализе датских семей с данной формой миопатии обнаружено сцепление локуса, ответственного за развитие заболевания, с областью 21q22.3, в которой расположен кластер генов, кодирующих а1 и ос2 цепи коллагена типа VI (Jobsis et al., 1995; Jobsis et al., 1996a). В большой франко-канадской семье, в которой одновременно наблюдали 19 пациентов, показано сцепление исследуемого локуса с маркерами D2S336 и D2S395, локализованными в 17-сМ области 2q37, в которой расположен ген аЗ цепи коллагена того же типа VI (Speer et al., 1996). В настоящее время идентифицировано19 типов коллагенов, состоящих из более чем 30 полипептидных цепей, кодируемых разными генами. Генетические дефекты некоторых типов коллагенов связаны с рядом моногенных заболеваний, таких как , синдром Элерса-Данлоса (тип IV и VII), синдром Альпорта, некоторые формы хондродисплазий. При этих заболеваниях нарушаются процессы посттрансляционного созревания либо протеолитического расщепления коллагеновых цепей, что приводит к неправильному спариванию мономеров либо к образованию мультимерных ансамблей большего размера.

Зрелые молекулы коллагеновых белков состоят из трех равномерно скрученных полипептидных а-цепей, образующих структуру трехгранного стержня. Разные типы коллагенов могут быть образованы либо тремя одинаковыми а-цепями, либо двумя или тремя различными полипептидами в соотношении 2:1 или 1:1:1 соответственно. Любая а-цепь содержит коллагеновый домен, на всем протяжении которого за исключением короткого С-терминального участка каждая третья аминокислота является глицином (Gly). Таким образом, молекулярная формула коллагенового домена может быть записана как (Gly-X-Y)n, где X и Y — аминокислоты неGly типа. Различные коллагеновые а-цепи различаются по количеству (Gly-X-Y) мотивов в коллагеновом домене и по конкретному содержанию аминокислот в X и Y положениях. Некоторые коллагены содержат также неколлагеновые домены. Присутствие глицина, самой небольшой из аминокислот, в каждом третьем положении коллагеновых полипептидных цепей существенно для их правильного скручивания в тройную спираль, так как глицин при этом занимает ограниченное пространство в центре триплекса. Поэтому любые мутации, приводящие к замене глицина на другую аминокислоту, будут сопровождаться локальным нарушением структуры тройной спирали. Все коллагеновые молекулы способны образовывать супрамолекулярные агрегаты, частично стаби­

лизированные за счет взаимодейсвий между триплексными доменами. Коллагены типов l,ll, III, V, VI и XI формируют фибриллыдо есть являются фибриллярными коллагенами. Коллагены типа IV агрегируются, образуя слои базальных мембран, коллагены VIII формируют десцеметовую мембрану и коллагены типа VII участвуют в образовании латерально агрегированных антипараллельных димеров, являющихся главным компонентом опорных фибрилл. На рис. 17 изображена структура коллагена. Предполагается, что среди большого семейства коллагенов широко экспрессирующийся микрофибриллярный коллаген VI типа выполняет роль моста между клетками и внеклеточным матриксом. Этот тип коллагена присутствует не только в эндомизии и перимизии скелетных

мышц, но и во многих других тканях.

Рис. 17. Структура коллагена

При секвенировании амплифицированных фрагментов кодирующих областей генов COL6A1 (collagen 6 alpha 1) и COL6A2, полученных от пациентов с миопатией Бетлема, ассоциированной с областью 21q22.3, в трех семьях были обнаружены две гетерозиготные миссенс-мутации. Одна соответственно в гене COL6A1, а другая однотипная мутация в двух семьях — в гене COL6A2 (Jobsis et al., 1996b). Обе мутации разрушали Gly-X-Y мотив в стержневом домене коллагена путем замещения глицина либо на валин, либо на серии. Гетерозиготное состояние по делеции одного нуклеотида в гене COL6A1 также приводит к развитию миопатии Бетлема (Lamandiet al., 1998). Эта мутация сопровождается преждевременной терминацией трансляции, при этом мутантная мРНК оказывается нестабильной и почти полностью отсутствует в фибробластах и в скелетных мышцах больных. При гаплонедостаточности по а1-цепи образуется уменьшенное количество структурно нормального коллагена VI. Предпо­

лагается, что структурные дефекты коллагена типа VI или уменьшение его содержания могут оказывать влияние на процессы дифференцировки миобластов либо, что более вероятно, на структурную организацию внеклеточного матрикса. Повидимому, в скелетных мышцах коллаген VI является критическим белком, участвующим в клеточно-матриксной адгезии.

1.7. Миопатии с цитоплазматическими и ядерными включениями в мышечных клетках

Миопатии, дебютирующие во взрослом возрасте, при которых наблюдается накопление в цитоплазме и/или в ядрах мышечных клеток патологических белковых агрегатов,

также, по нашему мнению, могут быть выделены в самостоятельную группу, несмотря на то что молекулярные механизмы формирования этих включений при разных заболеваниях могут значительно различаться. В последнее время широко обсуждается роль подобных образований в развитии нейродегенеративных процессов при таких разных заболеваниях, как болезнь Альцгеймера, некоторые семейные формы болезни Паркинсона и бокового амиотрофического склероза, а также болезни, связанные с экспансией CAG-повтора, такие как хорея Гентингтона, болезнь Кеннеди, целая серия спиноцеребеллярных атаксий. Более подробно эти вопросы будут обсуждаться во второй и пятой частях монографии. В общем виде можно сказать, что накопление нерастворимых белковых агрегатов в клетках тесно связано с их апоптозом и, по-видимому, является причиной избирательной гибели определенных типов клеток или даже тканей. В данном разделе мы подробно обсудим три формы миопатии, при которых наиболее отчетливо прослеживается связь между наличием белковых агрегатов в мышечных клетках и их гибелью. Это окулофарингеальная и десмин-родственные миопатии, а также моногенные миопатии с инклюзионными тельцами. а) Миопатия окулофарингеальная (MIM: 164300)

Эту форму аутосомно-доминантной миопатии следует отнести к относительно редким, возникающим в зрелом возрасте и медленно текущим заболеваниям. Клинически болезнь проявляет себя как «локальная миопатия». Поражаются мышцы, осуществляющие движения глазных яблок и мышца, поднимающая верхнее веко. Фарингеальные расстройства обусловлены включением в процесс констрикторов глотки, что затрудняет глотание. Типична симметричность процесса. Начальные признаки болезни относятся к 30—40 гг. в виде двустороннего опущения верхнего века с появлением ограничения движения глазных яблок. Как правило, на диплопию больные не жалуются. Объяснение этому находят в медленном и симметричном развитии парезов глазодвигательных мышц. Значительно утежеляют заболевание и ухудшают прогноз фарингеальные симптомы. Начинаясь с дизфагии, они имеют тенденцию к нарушению функций в виде афагии. Следует иметь в виду существование окулярной миопатии, при которой фарингеальные расстройства не выражены. Этот вариант миопатии рассматривается одними исследователями как самостоятельное заболевание, другими — как дебют окулофарингеальной миопатии. Диагности-

чески значимым признаком заболевания является появление в ядрах волокон скелетных мышц необычных тубулофи-

ламентных включений. При электронно-микроскопическом анализе образцов биоптатов мышц пациентов наблюдаются увеличенные с необычными кристовидными включениями.

С использованием техники микросателлитного картирования ген OPMD (oculopharyngeal muscular dystrophy) был

локализован в 5-сМ интервале в области 14q11.2-q13 в непосредственной близости от двух тандемно расположенных генов тяжелых цепей b-миозина шестого и седьмого типов — MYH6 и MYH7 (Brais et al., 1995). Было высказано предположение, что один из этих генов дефектен при окулофарингеальной миодистрофии. Однако в дальнейшем эта гипотеза не нашла подтверждения. Конструирование космидной библиотеки геномной ДНК, заключенной между двумя ближайшими маркерами — D14S990 и D14S1457, фланкирующими ген OPMD, явилось основой для изоляции из этой области более 30 кДНКовых последовательностей, три из которых имели высокий процент гомологии с бычьим геном поли(А)связывающего белка 2 (Brais et al., 1998).

Ранее ген поли(А)-связывающего белка 2 человека

(РАВР2 — eoly(A)-banding grotein 2) был картирован методом флюоресцентной гибридизации in situ в области 14q11. Псев-

доген РАВР2 расположен в области Xq12-q13. Кодирующая часть РАВР2 разделена на 7 экзонов. Обнаружено большое число транскрипционных изоформ гена, образующихся за счет альтернативного сплайсинга. В частности, интроны 1 и 6 представлены более чем в 60% транскриптов. Высокий уровень экспрессии гена РАВР2 наблюдается во многих тканях, в том числе и в скелетных мышцах. Продукт этого гена лока­

лизован исключительно в ядрах, где он действует как фактор полиаденилирования мРНК.

Локализация и характер экспрессии РАВР2 дали основание для его исследования в качестве кандидатного гена, ответственного за окулофарингеальную миопатию. Однако

при молекулярном анализе около 93% кодирующей части гена РАВР2 методами SSCP-анализа и обратной ПЦР (RT-PCR) мутаций у пациентов выявить не удалось. При этом анализе первый экзон гена РАВР2 не был исследован, так как он содержит трудно поддающуюся амплификации 400-нуклеотидную GC-богаую область, включающую стартовый кодон. Оказалось, что в этой области локализован (GCG)6-noBTop, ко­

дирующий 6 первых аланинов в цепочке из 10 аланиновых остатков в поли(А)-связывающем белке 2. Анализ этой области с использованием специально разработанных условий амплификации показал, что у пациентов с окулофарингеальной миодистрофией наблюдается мейотически стабильная экспансия GCG-повтора до 8—13 триплетов, причем чаще всего встречается (GCG)9-noBTop (Brais et al., 1998). Таким образом, было доказано, что гены OPMD и РАВР2 идентичны. При обширных популяционных исследованиях, проведенных в Канаде, был обнаружен полиморфизм по количеству GCG триплетов в первом экзоне РАВР2 гена. В 98% нормальных хромосом содержится (GCG)6-noBTop, тогда как в 2% — (GCG)7-noBTop. Оказалось, что пациенты с аутосомно-рецессивным вариантом заболевания несут (GCG)7-noBTop в гомозиготном состоянии, а в наиболее тяжелой форме болезнь протекает у гомозигот по (GCG)9-noBTopy, а также у компаунд-гетерозигот по (GCG)7/(GCG)9 аллелям. Следовательно, (GCG)7-noBTop является примером аллеля, который может действовать либо как модификатор при доминантной форме болезни, либо как рецессивная мутация.

Окулофарингеальная миодистрофия является первым примером заболевания, обусловленного очень короткой экспансией тринуклеотидного GCG-повтора, расположенного в кодирующей части гена. В настоящее время описано два других редких наследственных заболевания, связанных с увеличением полиаланиного трека в белковых продуктах соответствующих генов: одна из доминантных форм синполидактилий и аутосомно-доминантная черепно-ключичная дисплазия. Однако в двух последних случаях мутации не вызваны

экспансиями какого-либо тринуклеотидного повтора, а являются дупликациями смеси синонимических кодонов в генах HOXD13 и ос-1 цепи кор-связывающего фактора (CBFA1) соответственно. Полиаланиновые треки найдены во многих ядерных белках, таких, например, как НОХ-белки, однако их функции пока неизвестны. Алании является высоко гидрофобной аминокислотой, присутствующей в корах белков. Предполагается, что полиаланиновые треки играют важную роль в процессе полимеризации. Показано, что полиаланиновые олигомеры черезвычайно устойчивы к химической

денатурации и энзиматической деградации. Поли(А)-связывающий белок 2 присутствует в клетках, главным образом в

димерной или олигомерной формах. Возможно, РАВР2-олигомеры, составленные из достаточного числа мутантных молекул, могут накапливаться в ядрах в качестве филаментных включений и вызывать гибель клеток. Подобная агрегация в ядрах нейронов мутантных белков с удлиненными по-

лиглютаминовыми треками обнаружена по крайней мере при четырех заболеваниях, обусловленных экспансией CAG-noвтора: при хорее Гентингтона, двух формах спиноцеребел-

лярной атаксии и при денторубральной паллидо-люисовой атрофии. Не исключено, что молекулярные механизмы патофизиологии некоторых болезней экспансии связаны с возможностью накопления в ядрах клеток мутантных гомополимерных доменов. Поскольку ген РАВР2 экспрессируется во многих типах тканей, остается неясным, с чем связан специфический характер накопления подобных филаментных включений у пациентов с окулофарингеальной миопатией. б) Миопатия дистальная с накоплением десминовых включений (MIM: 125660). Десмин-родственная миопатия (OMIM: 601419)

Аутосомно-доминантная форма миопатии, дебютирующая во второй декаде или во взрослом возрасте слабостью проксимальных и дистальных мышц конечностей, а также мышц шеи и носоглотки. Нередко отмечается кардиомиопатия и катаракта. В саркоплазме сердечной и скелетных мышц больных обнаруживаются плотные гранулофиламентные агрегаты, в которых накапливается десмин — белок, принадлежащий семейству промежуточных филамент типа III. Промежуточные филаменты наряду с актиновыми микрофиламентами и тубулиновыми микротрубочками представляют собой третий класс хорошо охарактеризованных элементов цитоскелета. Десминовые филаменты специфичны для мышечных клеток. Они участвуют в дифференцировке миофибрилл и в поддержании структурной целостности скелетных мышц (Fuchs et al., 1998). С генетической точки зрения десмин-родственная миопатия представляет собой гетерогенную группу заболеваний.

С использованием методов гибоидизации in situ ген десмина — DES (desmin). был локализован в длинном плече хромосомы 2 в районе 2q35 (Viegas-Pequignot et al., 1989). Для того чтобы определить потенциальную роль гена DES в развитии десмин-родственной миопатии, была определена нуклеотидная последовательность его кодирующей области — кДНК. В трех больших семьях с десмин-родственной миопа­

тией мутаций в гене DES у больных не были найдено (Vicart et al., 1996). Однако в дальнейшем у пациентов из двух других подобных семей были идентифицированы миссенс-мутации в гене DES, сопровождающиеся аминокислотными заменами в высококонсервативном карбокси-терминальном конце стержневого домена десмина (Goldfarb et al., 1998). Гетерозиготная миссенс-мутация А337Р найдена у пациентов со взрослой формой миопатии. Тогда как пациенты из другой семьи, характеризующиеся дебютом в детском возрасте и более злокачественным течением миопатии, сочетающейся с кардиомиопатией, оказались компаунд-гетерозиготами по двум миссенс-мутациям — А360Р и N393I.

Генетический анализ с использованием 280 микросателлитных маркеров, выполненный в большой французской семье, где на протяжении трех поколений наблюдали пациентов с десмин-родственной миопатией, позволил локализо-

10 Заказ № 170

вать второй мутантный ген — DRM (desmin-related myopathy), в 26-сМ интервале в области 11q21-q23 (Vicart et al., 1998). В этом районе содержится ген CRYAB (crystallin alpha В)» кодирующий аВ-кристаллин — 20-кД мажорный белок хрусталика, присутствующий также в ряде других тканей, включая сердечную и скелетные мышцы. Показано, что аВ-кристаллин взаимодействует с десмином в сердечной мышце. Это доказывает его участие в образовании сети промежуточных филамент. аВ-кристаллин принадлежит к семейству малых белков теплового шока (shsp) и обладает активностью молекулярного шаперона. Наблюдается гиперэкспрессия этого белка в сердечной мышце при стрессовых ситуациях.

У всех больных из исследуемой французской семьи обнаружена однотипная миссенс-мутация — R120G, в высококонсервативной позиции гена CRYAB. Трансфекция мутантной кДНК гена CRYAB в культивируемые клетки мышц приводит к образованию внутриклеточных агрегатов, со­

держащих десмин и аВ-кристаллин, подобно тому как это происходит в мышечных волокнах больных с десмин-родственной миопатией. Таким образом, доказана идентичность генов CRYAB и DRM. Аутосомно-доминантная врож­

денная катаракта связана с миссенс-мутацией R116C в гене CRYAA, кодирующем otA-кристаллин. Примечательно, что 116 позиция в аА-кристаллине соответствует 120-й позиции в осВ-кристаллине. Это еще раз указывает на высокую функциональную значимость аргинина в данном положении а-кристаллинов. Поздний дебют заболевания может быть объяснен, по-видимому, тем, что R120G мутация оказывает повреждающий эффект на мышцы после длительного периода сократительной активности.

в) Миопатия с инклюзионными тельцами,

аутосомно-доминантная (MIM: 147420); аутосомно-рецессивная (OMIM: 601073)

Гетерогенная группа миопатии с уникальными гистологическими особенностями мышечных волокон, включающими обрамленные вакуоли с концентрированными мембранными телами и инклюзионными тельцами в цитоплазме и ядрах, состоящими из скрученных филамент диаметром 15—18 нм, без сопутствующих воспалительных инфильтратов. Заболевание дебютирует в возрасте около 50 лет в виде прогрессирующей мышечной слабости плечевого и тазового поясов. В последующем развиваются атрофии мышц дистальных сегментов конечностей, шеи и туловища. Характерна хроническая респираторная недостаточность.

Описаны как аутосомно-рецессивная, так и аутосомно-доминантная формы заболевания. Аутосомно-рецессивная форма специфически распространена среди еврееввыходцев из Персии. При генетическом анализе 9 таких семей обнаружено сцепление мутантного гена IBM2 (inclusion body myopathy 2) с маркерами центромерной области хромосомы 9 (9p1-q1) (Mitrani-Rosenbaum et al., 1996). Локализация гена IBM1, связанного с доминантной формой инклюзионной миопатии, в настоящее время неизвестна.

1.8. Митохондриальные миопатии

В отечественной литературе подробное описание митохондриальных болезней представлено в недавно вышедшем руководстве, посвященном наследственным болезням нервной системы (Вельтищев и др. 1998). Согласно данному руководству, под митохондриальными болезнями понимается «гетерогенная группа заболеваний, обусловленных генетическими, структурными и биохимическими дефектами митохондрий». В большинстве своем митохондриальные болезни носят синдромальный характер, при этом мышечная слабость часто занимает одно из ведущих мест в структуре синдромального поражения. Поэтому мы сочли возможным дать описание этих болезней в данной части монографии.

Среди митохондриальных миопатии первоначально были выделены мегакониальная (MIM: 255140), плеокониальная (MIM: 262900) и гиперметаболическая (MIM: 238800) формы миопатии. В первом случае имеет место увеличение размеров митохондрий, во втором — их числа, в тре­

тьем — гиперактивность митохондриальных ферментов. Следует отметить, что при некоторых митохондриальных миопатиях у одного и того же больного увеличение числа митохондрий может сочетаться с увеличением их размеров. Иногда митохондрии содержат аномальные квадриламинарные структуры.

Клиническая картина митохондриальных миопатии складывается из слабости мышц, начинающейся с мышц тазового пояса, и постепенной их атрофии. Для митохондриальных миопатии характерно медленно прогрессирующее течение. У больных может наблюдаться гипотония, гипорефлексия, задержка моторного развития, гепатомегалия, макроглоссия. Описаны ранние формы заболевания, напоминающие по клиническому течению детскую спинальную амиотрофию Верднига-Гоффмана, обычно с летальным исходом. Митохондриальные миопатии могут проявлять себя клинически не только синдромом миопатии с диффузной слабостью, но и приступами, напоминающими пароксизмальный паралич. Отличительной особенностью гиперметаболической миопатии (бо­

лезнь Люфта) являются помимо мышечной слабости такие симптомы, как диффузная потливость, полидипсия, астения с резко усиленным основным обменом при нормальной функции щитовидной железы.

Митохондриальные миопатии могут спровождаться тремя типами нарушений на биохимическом уровне: (1) дефектами в утилизации субстратов, обусловленными недостаточностью карнитина, карнитин палмитоилтрансферазы (см. ниже) или различных компонентов пируват-дегидрогеназного комплекса; (2) дефектами в митохондриальной системе окислительного фосфорилирования, как в случае болезни Люфта или при недостаточности мтАТФазы и (3) дефектами в компонентах митохондриальной дыхательной цепи, таких как белок негемного железа (nonheme iron protein), цитохромоксидаза, цитохром р и NADH-CoQ-peдуктаза (Land et al., 1981). Наследственные формы митохондриальных миопатии не обязательно связаны с дефектами в митохондриальной ДНК (мтДНК), а могут быть обусловлены доминантными или рецессивными мутациями в аутосомных генах (Harding et al., 1988). В данном разделе мы остановимся на заболеваниях, обусловленных только генетическими дефектами митохондрий, и, кроме того, таких, для которых проведена идентификация молекулярного дефекта. В значительном проценте случаев при подобных митохондриальных болезнях наблюдается гетероплазмия, то есть сосуществование в клетках в различных пропорциях мутантных и нормальных митохондрий. Это связано с особенностями репликации и сегрегации мтДНК.Уровень гетероплазмии в разных тканях одного и того же пациента может быть различен.

Более 15 лет тому назад был полностью секвенирован митохондриальный геном, состоящий из 16 569 нуклеотидов и содержащий 22 гена транспортных РНК, 2 гена рибосомальной РНК и 13 белковых генов, кодирующих субъединицы пяти комплексов окислительного фосфорилирования. 56 субъединиц этих комплексов кодируется ядерными генами. 7 субъединиц NADH-дегидрогеназы комплекса I дыхательной цепи кодируются митохондриальными генами (MTND1 -7) и около 35 — ядерными. Три субъединицы

(I-III) цитохромоксидазы С кодируется митохондриальной ДНК и десять — ядерной. На рис. 18 схематически представлена организация митохондриального генома и указаны мутации, идентифицированные у пациентов с различными типами митохондриальных болезней.

 

Рис. 18. Организация митохондриального генома с указанием мутаций, идентифицированных у пациентов с различными типами митохондриальных болезней

Точковые мутации в митохондриальных генах MTND1-7 являются причиной развития синдрома Лебера — наследственной атрофии зрительных нервов — LHON (MIM 535000).

150

Атрофия зрительного нерва при синдроме Лебера часто сочетается с неврологической симпоматикой в виде ранней

дистонии, периферической полиневропатии, тремора, атаксии. Заболеванию могут сопутствовать головные боли, сердечная аритмия. Наиболее частыми при синдроме Лебера являются нуклеотидные замены в положениях 11778, 3460, 15257 и 14484 мтДНК. Эти мутации рассматриваются в качестве первичных, и они обнаруживаются более чем у 90% пациентов с митохондриальной формой этого заболевания. Кроме того, описано около 20 других точковых мутаций в генах MTND1-7, которые также приводят к атрофии зрительного нерва. Эти мутации рассматриваются в качестве вторичных, так как при их сочетании с первичными мутациями формируется плейотропный фенотип синдрома Лебера.

Другие мутации в мтДНК (делеций, дупликации, точковые мутации), приводящие к дефициту одного или нескольких ферментов в митохондриальной респираторной цепи, являются первичными молекулярными дефектами при различных наследственных болезнях, получивших название митохондриальных энцефаломиопатий (Shoffner, Wallace, 1995). Как правило, это мультисистемные заболевания с преимущественным вовлечением в патологический процесс высоко-аэробных, постмитотических тканей, таких как сердечная и скелетные мышцы, а также центральная нервная система. Точковые мутации в мтДНК, кодирующей тРНК, также являются частой причиной таких болезней. Более 25 мутаций зарегистрировано в 10 из 22 митохондриальных генов тРНК (Wallace et al., 1995). Некоторые из этих мутаций связаны с неврологическими синдромами, такими как митохондриальные энцефаломиопатий включая лактоацидоз в сочетании с инсульт-подобными эпизодами — MELAS синдром; миоклонус-эпилепсия с «рваными» красными волокнами мышц, образование которых обусловлено скоплением аномальных ми­

тохондрий по краю мышечного волокна — MERRF-синдром; прогрессирующая офтальмоплегия — СРЕО-синдром. Другие мутации в митохондриальных генах тРНК приводят к изолированным миопатиям, кардиомиопатиям или мультисистемным заболеваниям. Некоторые специфические мутации связаны с определенным клиническим фенотипом, тогда как

другие мутации в разных семьях могут выражаться по-разному. Ген MTTL1, кодирующий лейциновую TPHK(Leu)(UUR), яв­

ляется «горячей точкой» для подобных мутаций. По крайней мере 11 различных мутаций идентифицировано в этом гене у пациентов с MELAS-синдромом, прогрессирующей офтальмоплегией, диабетом в сочетании с глухотой, с миопатией или кардиомиопатией. Примером может служить A3243G замена в гене MTTL1. У 80% пациентов с MELAS-синдромом обнаруживается подобная мутация. При этом доля мутантных митохондриальных геномов варьирует у пациентов от 56% до 95% и значительно выше,чем у здоровых родственников пробандов. В контрольных группах подобной мутации не обнаруживается. У ряда пациентов найдена мутация в положении 3271 того же гена. Мутации в этом митохондриальном гене обнаружены при ряде других заболеваний, таких как MERRF синдром (С3256Т), кардиомиопатия с/или без слабости скелетной мускулатуры (A3260G, СЗЗОЗТ), митохон-

дриальная энцефаломиопатия (С3252С) и диабет II типа в сочетании с нейросенсорной тугоухостью. В то же время в гене MTTL2, кодирующем другую лейциновую TPHK(Leu)(CUN), описано всего несколько мутаций, в том числе G12315A, у пациента с прогрессирующей офтальмоплегией, слабостью конечностей, нейросенсорной тугоухостью и пигментной ре­

тинопатией, а также A12320G — у пациента с миопатией (Fuetal.,1996). Точные молекулярные основы подобных различий во взаимоотношениях генотип-фенотип остаются непонятными.

Мутации в митохондриальном гене треониновой тРНК(ТГ1Г) в положении 15924 и 15923 обнаружены у пациентов, умерших в первые дни после рождения от тяжелой дыхательной недостаточности, обусловленной лактоацидозом (Yoon et al., 1991). В другой семье наблюдали гомоплазмию по 15924 мутации у здоровой женщины и у ее сына, умершего в возрасте 4 месяцев от тяжелого лактоацидоза с выраженными дефектами митохондрий в сердечной и в скелетных мышцах. Биохимический, гистологический и клинический анализы не выявили каких-либо аномалий у его матери (Zheng et al., 1989). Более того, подобная мутация обнаружена у 11% нормальных доноров, тогда как 15923 мутация не найдена среди европейцев, азиатов и африканцев (Brown et al., 1992). При молекулярном анализеЮ ядерных и 25 митохондриальных кандидатных генов у пациентов с недостаточностью цитохромоксидазы С были найдены мутации в гене сериновой TPHK(Ser)(UCN) в подгруппе больных с синдромальной энцефалопатией (Jaksch et al., 1998). Потеря субъединиц цитохромоксидазы С, кодируемых митохондриальными генами, наблюдается при летальной кардиоэнцефаломиопатии новорожденных, а также при синдроме Лейгха — младенческой некротической энцефалопатии (MIM 308930). Однако в последних двух случаях первичный дефект связан с мутациями в ядерных генах, продукты которых участвуют в биогенезе комплекса цитохромоксидазы С, — SC02 и SURF1 соответственно (Papadopoulou et al., 1999; Zhu et al., 1998).

Недавно был разработан высокоэффективный метод, основанный на градиентном денатурирующем гель-электрофорезе, позволяющий одновременно сканировать мутации во всех 22 митохондриальных генах тРНК и во фланкирующих областях, а также обнаруживать гетероплазмию (Sternberg et al., 1998). При анализе этим методом 35 пациентов с клиническим диагнозом митохондриальной энцефаломиопатий у 25 были обнаружены мутации по крайней мере в одном из генов тРНК. Всего было выявлено 46 мутаций (41 замена нуклеоида, 4 коротких инсерции и одна небольшая делеция). 20 из этих мутаций были описаны впервые. По 40 мутациям наблюдалась гомоплазмия, по 6 — гетероплазмия. 22 мутации оказались локализованы в генах тРНК и 24 во фланкирующих районах, из них 12 мутаций в митохондриальных генах, кодирующих белки, 2 мутации в генах рибосомальной РНК и 10 — в некодирующих районах. Таким образом, мутации в генах тРНК являются основной причиной митохондриальных энцефаломиопатий и, как правило, по ним наблюдается гомоплазмия.

Описано много случаев энцефаломиопатий, связанных с различными протяженными делециями и дупликациями митохондриальной ДНК. Среди них ведущее место занимает синдром Кернса-Сейра. Для подобных митохондриальных болезней характерна гетероплазмия, причем тяжесть течения заболевания, как правило, коррелирует с количеством мутантных митохондрий.

а) Миопатии митохондриальные с делециями и дупликациями митохондриальной ДНК (MIM:

550000,160550); синдром Кернса-Сейра (MIM:

530000)

При исследовании 123 пациентов с различными митохондриальными миопатиями и энцефалопатиями у 32 были обнаружены делеции митохондриальной ДНК (рис. 18) в мышечной ткани (Moraes et al., 1989). Величина этих делеций варьировала от 1.3 до 7.6 кб, 11 пациентов имели одинаковую делецию размером 4.9 кб. Впервые мутации в мтДНК были идентифицированы у пациентов с митохондриальной миопатией (Holt et al., 1988). При анализе 25 таких больных у 9 в мышечных клетках была обнаружена гетероплазмия, то есть существование двух популяций мтДНК — нормального размера и с делецией около 7 кб. В одной большой итальянской семье с пятью больными с диагнозом митохондриальной миопатии, сочетающейся с катарактой (MIM: 160550) были обнаружены множественные делеции мтДНК, начало которых было локализовано в небольшой 12-нуклеотидной области на 5′ конце D-loop района — сайта активного взаимодействия ядерной и мтДНК (Zeviani et al., 1989). Анализ был проведен путем амплификации и секвенирования этой области мтДНК. Не исключено, что мутации в ядерных генах, контро-

лиующих взаимодействие ядерной и мтДНК, могут приводить к специфическому наследуемому разрушению целостности митохондриального генома.

Различные делеций митохондриального генома были обнаружены в другой семье, где пробанд имел атаксию, эпизодическую кетоацидозную кому и миопатию. При этом делеций обнаружены не только у пробанда, но и у его здоровой матери и у ее сестры (Cormier et al., 1991). Выявлен дефект окислительного фосфорилирования в скелетных мышцах и в лимфоцитах больного. Все делеций локализованы между генами СОХ II и цитохрома р. Делеций наследуются по аутосомно-доминантному типу. Предполагается, что за митохондриальные

делеций ответственен фактор, кодируемый ядерным геном, возможно, приводящий к нарушениям в системе репарации.

В одной финской семье с офтальмоплегией и миопатией у 9 ее членов также были обнаружены делеций мтДНК различной протяженности (Suomalainen etal., 1992). Наибольший процент делетированной мтДНК найден в мозге, скелетных мышцах и в сердце. Тяжесть течения заболевания коррелирует с количеством мутантной мтДНК. У некоторых пациентов с митохондриальными миопатиями присутствуют не

делеций, а дупликации мтДНК (Poulton et al., 1988).

Основной причиной развития синдрома Кернса-Сейра, характеризующегося прогрессирующей хронической офтальмоплегией, пигментной дегенерацией сетчатки, кардиомипатией, а также дебютирующими в более позднем возрасте атаксией и мышечной слабостью, являются протяженные делеций митохондриальной ДНК размером примерно от 2 до более чем 7 кб (Zeviani et al., 1988; Johns et al., 1989; FischelGhodgian et al., 1992). При этом наблюдается выраженная гетероплазмия и доля мутантных мтДНК в мышечной ткани обычно варьирует в пределах от 45% до 75%. В фибробластах больных процент мутантных митохондрий значительно ниже. Делеций часто включают 8993 позицию мтДНК, являющуюся мутантным сайтом в гене АТФ-синтетазы комплекса V (МТАТР6) при NARP-синдроме (нейропатия, атаксия, пигментный ретинит — MIM: 551500 и 516060).

Неожиданным оказалось то, что одна и та же делеция размером в 4977 нуклеотидов была идентифицирована при двух очень разных митохондриальных болезнях: при синдроме Кернса-Сейра и при синдроме Пирсона (MIM: 557000), ведущим симптомом которого является нарушение экзокринной функции поджелудочной железы (Fischel-Ghodgian et al., 1992). Однако процентное содержание делетированной мтДНК в разных тканях пациентов значительно различается при этих двух заболеваниях. В первом случае мутантная мтДНК преимущественно обнаруживается в мышцах и в ЦНС, тогда как ее распределение при синдроме Пирсона не имеет выраженной тканеспецифичности. Описаны случаи, когда у больных с клиническим диагнозом синдрома Пирсона появляются симптомы синдрома Кернса-Сейра. Показано, что в этих случаях у пациентов меняется характер гетероплазмии и мутантная мтДНК преимущественно локализуется в мышечных тканях. Таким образом, не столько размер делеций и их локализация в геноме митохондрий, сколько распределение мутантной мтДНК в разных тканях имеет критическое значение для клинического проявления последствий этих мутаций. У некоторых пациентов с синдромом Кернса-Сейра идентифицированы точковые мутации в генах тРНК, и в частности в гене лейциновой тРНК (Leu>(CUN).

Интересным представляется вопрос о причинах возникновения делеций в мтДНК. В ряде случаев делеции возникают вследствие мутаций в ядерных генах и наследственная передача соответствующих заболеваний подчиняется законам Менделя. Однако возникновение других делеций может быть связано со структурными особенностями митохондриального генома. Так, показано, что у некоторых пациентов с синдромом Кернса-Сейра точки разрывов делеций локализованы внутри прямого канонического повтора длиной от 13 до 18 нуклеотидов, расположенного в различных районах митохондриального генома (Johns et al., 1989). Иногда оказывается, что последовательности, граничащие с делециями, способны образовывать шпилечные структуры, что также рассматривается как фактор дестабилизации мтДНК. Высказано предположение, что делеции в мтДНК являются результатом более сложных генетических перестроек (Poulton et al., 1994). Оказалось, что у многих пациентов с синдромом Кернса-Сейра в мтДНК наряду с делециями присутствуют определенные дупликации, причем эти дуплицированные области часто отсутствуют у пациентов с прогрессирующей офтальмоплегией (СЕРО). По-видимому, баланс между перестройками в мтДНК является центральным звеном в патогенезе этой уникальной группы заболеваний.

Несмотря на то что в мышечной ткани пациентов с синдромом Кернса-Сейра процент мутантной мтДНК достаточно высок, в культуре сателлитных клеток, полученных из биоптатов тех же самых мышц пациентов, мутантные митохондрии обнаруживаются редко (Shoubridge et al. 1998). Высказано предположение, что восстановление нормального генотипа мтДНК в мышцах больных может быть достигнуто путем стимуляции регенерации мышечных волокон, так как именно сателлитные клетки ответственны за этот процесс. Для испытания этой гипотезы была проведена повторная биопсия одного и того же участка мышц больного с синдромом Кернса-Сейра. Оказалось, что в регенерирующих волокнах, образовавшихся после первой биопсии, наблюдается гомоплазмия по мтДНК дикого типа, тогда как в большинстве нерегенерирующих волокон процент мутантной мтДНК сохранется на прежнем уровне. Эти результаты позволяют надеяться на возможность улучшения функции мышц у подобных пациен­

тов путем инкорпорации сателлитных клеток в мышечные

волокна.

1.9. Метаболические миопатии

Наследственные дефекты различных мышечных ферментов являются причиной развития относительно доброкачественных метаболических миопатии. В качестве примера мы рассмотрим миопатии, обусловленные недостаточностью мышечной фосфорилазы (болезнь Мак-Ардла), карнитин пальмитоилтрансферазы I, миоаденилат дезаминазы (миопатия Спряжения) и фосфоглицератмутазы.

а) Гликогеноз 5 типа, гликогеноз мышечный, Мак-

Ардла болезнь (MIM: 232600)

Гликогеноз 5 типа, или болезнь Мак-Ардла, проявляется уже в детском возрасте прогрессирующей мышечной слабостью, патологической утомляемостью мышц, а также болезненными тоническими судорогами, возникающими при утомлении. Тонические спазмы возникают чаще при физической нагрузке в условиях ишемии. Тоническое сокращение может быть генерализованным и сопровождаться побледнением, сердцебиением, повышенным потоотделением. Течение заболевания медленно прогрессирующее, приводящее к формированию мышечных контрактур. Биохимической основой заболевания является дефицит мышечной фосфорилазы, составляющей 5% всего растворимого белка мышц. При этом мышечная фосфорилаза у части больных может присутствовать, хотя активность ее, как правило, резко снижена. Найдена очень низкая концентрация пиридоксина в мышцах больных. Пиридоксинфосфат — ковалентно связанный кофактор гликогенфосфорилазы, одна молекула витамина связывается с лизиновым остатком каждой субьединицы фермента.

                Хромосомная            принадлежность          гена        PYGM

(ghosphorylase glycogen muscle) была установлена путем гибридизации геномной ДНК, изолированной из отдельных хромосом, с олигонуклеотидными ДНК-зондами, соответствующими карбокси-терминальному району мышечной фосфорилазы. Хромосомы отбирали методом лазерного сортинга из клеточных линий, содержащих различные транслокации. Таким образом удалось показать, что ген PYGM расположен в 11-й хромосоме (Lebo et al., 1984). В дальнейшем локализация гена была уточнена методом соматической гибридизации. При этом был использован набор клеточных клонов, содержащих различные терминальные делеции 11-й хромосомы. Метод флюоресцентной гибридизации in situ позволил уточнить локализацию гена PYGM в проксимальном районе 11 q 13 (Lebo et al., 1990). Одновременно из тканеспецифической экспрессионной библиотеки генов мышц человека были выделены кДНКовые клоны мышечной фосфорилазы и с их помощью изолирована специфическая мРНК размером 3.4 кб (Gautron et al., 1987). Определена интрон/экзонная структура гена PYGM (Burko et al., 1987). ВЗ’-области гена PYGM найден полиморфизм по сайту рестрикции для Msp1, информативность которого оказалась достаточна для проведения пренатальной диагностики в 75% семей высокого риска. Затем были описаны более информативные внутригенные мини- и микроса­

теллитные повторы, легкогенотипируемые методом ПЦР

(Iwasaki et al., 1992).

При гликогенозе 5 типа мРНК гена PYGM либо отсутствует, либо ее содержание значительно снижено. В последнем случае равмер транскрипта чаще всего нормальный. По-видимому, крупные делеций и другие структурные перестройки в области PYGM гена встречаются нечасто. При молекулярном обследовании 40 неродственных пациентов с синдромом Мак-Ардла в гене PYGM были идентифицированы 3 различные точковые мутации, одна нонсенс типа — R49X и 2 миссенс — G204S и K542W (Tsujino et al., 1993а). Все три мутации встречались неоднократно у разных пациентов и в разных сочетаниях. Нонсенс-мутация R49X, возникающая в результате замены тимина на гуанин в 49-м кодоне первого экзона и приводящая к образованию стоп-кодона на месте аргинина в белке, оказалась наиболее мажорной. 18 пациентов из 40 исследуемых были гомозиготны по этой мутации. Две другие миссенс-мутации в экзонах 5 и 14 соответственно также могут быть отнесены к классу мажорных. Так, 6 из 40 пациентов были компаунд-гетерозиготами по трем известным мутациям и у 11 пациентов был идентифицирован один из этих трех мутантных аллелей. Только у пяти больных мутации в PYGM гене не были обнаружены. В дальнейшем было идентифицировано еще несколько точковых мутаций в гене PYGM у больных с синдромом Мак-Ардла (Tsujino et al., 1995).

б) Миопатия с дефицитом карнитин

пальмитоилтрансферазы I (MIM: 255110)

Заболевание относится к группе метаболических аутосомно-рецессивных миопатии с недостаточностью карнитин пальмитоилтрансферазы I — фермента энергетического метаболизма, участвующего в митохондриальном бета-окислении длинноцепочечных жирных кислот путем их конъюгации с L-карнитином. Этот шаг необходим для прохождения жирных кислот через мембрану митохондрий. При недостаточности фермента у больных наблюдаются мышечные боли в сочетании с миоглобинурией, часто индуцируемые физическими упражнениями, голодом или жирной пищей. В зависимости от дебюта клинические проявления заболевания могут быть различными. Для взрослых пациентов характерны мышечная слабость с периодическими нарушениями походки, судорожные сокращения мышц (типа крампи), миоглобинурия. При дебюте заболевания в детском возрасте у больных развивается гипераммониемия, наблюдается повышенный уровень сывороточных трансаминаз и свободных жирных кислот плазмы, гепатомегалия, некетонная гипоглицемия и кома. Недостаточность по карнитин пальмитоилтрансферазе I — одно из немногих наследственных заболеваний, которые коррегируются диетой, содержащей среднецепочечные триглицериды.

Клонирована и секвенирована полноразмерная кДНК гена СРТ1 (carnitine palmitoyltranferase I), кодирующая белок, состоящий из 658 аминокислот, включая 25 остатков лидерного МН2-пептида (Finocchiaro et al., 1991). С использованием кДНКовых зондов ген СРТ1 был картирован методами соматической гибридизации и флюоресцентной гибридизации in situ в области 1р13-р11 (Minoletti et al., 1992).

Идентифицированы две мажорные миссенс мутации в СРТ1 гене у больных, страдающих недостаточностью карнитин пальмитоилтрансферазы I. Одна из них — замена С на Т в 439 положении, приводящая к замене серина на лейцин в

113 положении белка. Эта мутация обнаруживается у взрос-

 

лых пациентов с относительно поздним началом заболевания (Taroni et al., 1993). Вторая мутация, найденная при детской форме заболевания, заключается в замене аргинина на цистеин в 631 положении белка (Taroni et al., 1992). Интересно отметить, что эта мутация часто обнаруживается в сочетании с двумя другими мутациями в СРТ1 гене — G1203A и V368I, которые сами по себе не приводят к заболеванию, а являются относительно редкими формами полиморфизмов. Однако эти же полиморфные мутации с повышенной частотой встречаются и при взрослых формах заболевания. Повидимому, сами эти замены не инактивируют фермент, но способны усиливать эффект мутаций, повреждающих активность фермента.

в) Миопатия напряжения (MIM: 102770)

Наследственная недостаточность АМФ-дезаминазы является причиной одной из форм миопатии напряжения, характеризующейся икроножными болями и слабостью верхних конечностей после упражнений. Миоаденилат дезаминаза, или аденозинмонофосфат (АМФ) дезаминаза, играет важную роль в пуриновом нуклеотидном цикле. Ее дефицит, повидимому, является наиболее общей причиной метаболических миопатии у человека и особенно состояний, провоцируемых физической нагрузкой. Уровень фермента на порядок выше в скелетных мышцах, чем в других тканях. Обобщенный опыт показывает, что в 1—2% исследуемых мышечных биоптатов наблюдается дефицит АМФ-дезаминазы. В норме активность АМФ-дезаминазы на 95% ингибируется ГТФ. Генетически детерминированное снижение чувствительности фермента к этому ингибированию, по-видимому, является основой развития наследственной первичной подагры.

Тканеспецифические изоформы АМФ-дезаминазы образуются за счет дифференциальной экспрессии двух генов в сочетании с альтернативным сплайсингом первичного

транскрипта одного из этих генов. С использованием методов соматической гибридизации и гибридизации in situ ген AMPD1 (adenosine monophosphate deaminase 1) локализован в области 1p21-p13 (Sabinaetal., 1990). Ген состоит из 16 экзонов, расположенных в участке геномной ДНК размером 20 тысяч пар оснований. В 0.6—2% мРНК гена AMPD1, экспрессирующегося в скелетных мышцах взрослых, в результате альтернативного сплайсинга отсутствует экзон 2. Однако образующаяся при этом делетированная форма фермен­

та функционально активна.

У большинства пациентов с миопатией напряжения, обусловленной недостаточностью АМФ-дезаминазы, одновременно присутствуют две мутации в гене AMPD1 в cis-поло-

жении (Morisaki et al. 1992). Одна из них — нонсенс-мутация в 12-м кодоне второго экзона, приводящая к преждевременной терминации синтеза фермента, что согласуется с отсутствием иммунореактивных форм белка у обследованных пациентов. Вторая — миссенс-мутация в 48-м кодоне третьего экзона. Этот полиморфный мутантный аллель встречается с частотой 12% среди представителей белой расы, с частотой 19% среди американцев африканского происхождения и полностью отсутствует среди японцев. Популяционная частота этого аллеля может обьяснить 2% зарегистрированных случаев дефицита АМФ-дезаминазы в биоптатах мышц. Присутствие в гомозиготном состоянии полиморфной миссенс-мутации у неродственных пациентов с недостаточностью АМФдезаминазы, одновременно гомозиготных по нонсенс-мутации, по-видимому, является результатом «эффекта основате­

ля», приведшего к распространению в Западной Европе этой комбинации аллелей в гене AMPD1. Клиническая гетерогенность недостаточности АМФ-дезаминазы частично может быть связана с изменчивостью в характере сплайсинга первичного РНК транскрипта в скелетных мышцах (Morisaki et al., 1993).

г) Миопатия, обусловленная недостаточностью фосфоглицератмутазы (MIM: 261670)

К основным клиническим признакам данной формы миопатии можно отнести следующие: мышечная слабость,

162

миалгия (часто по типу крампи), провоцируемая физическими нагрузками, миоглобинурия, повышенная активность сывороточной креатинкиназы, почечная недостаточность.

Фосфоглицератмутаза — димер, две изоформы которого — медленно мигрирующая мышечная (М) и быстро мигрирующая мозговая (В) содержатся в различных тканях в разных пропорциях. Эти изоформы кодируются разными генами. Семейство включает также бифосфоглицератмутазу.

Полноразмерная кДНК мышечной субъединицы фермента клонирована (Shanske et al., 1987). Блот гибридизация по Саузерну геномной ДНК с кДНКовыми зондами выявила существование мультигенного семейства PGAM в геноме человека, причем в разных тканях происходит специфическая транскрипция различных PGAM генов. В-субьединица преимущественно экспрессируется в красных клетках крови, в печени и в мозге, тогда как М-субъединица — в мышцах и обе субъединицы экспрессируются в сердце. Ген мышечной фосфоглицератмутазы — PGAMM (gihosphoglycerate rnutase М) картирован в области 7р13-р12 (Mattei et al., 1989). Ген содержит 3 экзона, распределенных на площади 2.83 кб геномной ДНК. Бифосфоглицератмутазный (BPGM) ген картирован в области 7q22-q34 и имеет высокий процент гомологии с PGAMM-геном и одинаковое количество и расположение интронов. При сравнении генов, кодирующих мышечные ферменты, обнаружена консервативная последовательность из 9 пар оснований в 5′-нетранслируемой области (GGGGCTGGG). По-видимому, эта последовательность связана с экспрессией мышечных ферментов.

Идентифицировано три точечных мутации в PGAMMгене у больных с миопатией, обусловленной недостаточнос­

тью фосфоглицератмутазы (Tsujino et al. 1993). При этом одна из них — нонсенс-мутация в 78-м кодоне, преимущественно встречается среди пациентов афро-американского происхож­

дения. Первый зарегистрированный пациент европейского происхождения оказался гомозиготен по миссенс-мутации в 90-м кодоне гена PGAMM.

 

 

ГЛАВА 2

БОЛЕЗНИ МЫШЦ. МИОТОНИЧЕСКИЕ

СИНДРОМЫ И ПЕРИОДИЧЕСКИЕ ПАРАЛИЧИ

2.1. Общая характеристика

В данной группе болезней мышц будут рассмотрены миотоническая дистрофия, миотония Томсена и периодические параличи. Для всех заболеваний, включенных в группу миотоний, специфичен феномен миотонии, состоящий в непроизвольном тоническом спазме мышц, возникающем вслед за резким произвольным сокращением. Расслабление наступает лишь через несколько секунд (до 30 сек.). Описанный феномен типичен для начального («стартового») движения. Повторные сокращения этих мышечных групп совершаются с меньшим затруднением, а затем вообще нормализуются. Медленные, слабые движения, как правило, не сопровождаются миотоническим спазмом.

Периодические параличи характеризуются своеобразными клиническими проявлениями в виде внезапной, приступообразной утраты способности производить активные движения. При этом мышцы утрачивают способность к сокращению. Страдает вся скелетная мускулатура. В зависимости от содержания калия в сыворотке крови различают гипер-, гипои нормокалиемические формы заболевания. Следует подчеркнуть, что уровень калия в сыворотке крови меняется только во время пароксизма. При всех формах периодического паралича наблюдаются специфические изменения морфологии мышечной ткани в виде дегенерации центральной части миофибрилл с последующим образованием вакуолей.

В табл. 10 представлена общая характеристика генов, ответственных за миотонические синдромы и периодические параличи.

Таблица 10 Молекулярно-генетическая характеристика миотонических   синдромов     и          периодических           параличей

Нозологическая

Ген,

Белок, функции

форма, MIM

локализация

Миотоническая

DM, DMPK

миотонин-протеинкиназа —

дистрофия,

цАМФ-зависимая серии/

160900

треонинкиназа

+

DMAHP

гомеодоменны

19q13.2-q13.3

транскрипционный фактор
Миотония врожденная

CLC1

хлорный канал

Томсена,

скелетных

160800;

мышц

Беккера болезнь, 255700

5q12.2-q13

Паралич

HYPP,

натриевый

периодический

SCN4A

канал тип 4,

гипер-

альфа

калиемический II,

170500; парамиотония Эйленбурга, 168300; атипичные

не индуцируемые

холодом миотонии,

168350; 170600

17q23.1-q25.3

Паралич

HOKPP,

кальциевый

периодический

CACNL1A

канал 1_типа,

гипокалиемический I, 170400

1q31-q32

альфа 1

С генетической точки зрения миотоническая дистрофия относится к группе болезней экспансии. Подобные заболевания обусловлены динамическими мутациями — увеличением (или экспансией) выше допустимого критического уровня числа копий повторяющихся элементов в мес-

166

тах локализации микрои минисателлитных последовательностей. Если подобные последовательности расположены в значимых областях генов, их экспансия может сопровож­

даться нарушением регуляции работы гена или образованием аномального продукта, обладающего определенной агрессивной функцией по отношению к тем клеткам, в которых этот ген экспрессируется. И то и другое может явиться причиной развития патологических процессов и реализоваться в виде наследственных заболеваний. Подробная характеристика болезней экспансии будет представлена во второй части монографии.

Миотонии, не сопровождающиеся мышечной дистрофией, и периодические параличи обусловлены мутациями в генах ионных каналов: в хлорном канале скелетных мышц при миотонии Томсена, в вольтаж-зависимых натриевом и кальциевом каналах L-типа при гипери гипокалиемических периодических параличах соответственно. Вольтаж-зависимые ионные каналы являются частью семейства макромолекул, функции которых включают контроль и поддержание внутриклеточного электропотенциала, секрецию и сигнальную трансдукцию (Bulman, 1997). На рис. 19 изображена структура трансмембранных вольтаж-зависимых калиевых и натриевых ионных каналов. Фундаментальной особенностью эволюционно родственного суперсемейства вольтаж-зависимых К+, Na+ и Са2+ каналов является присутствие ряда из шести трансмембранных сегментов (S1-S6), формирующих отдельный домен. Один такой домен представлен в калиевых каналах и четыре подобных

домена образуют альфа1 субъединицы натриевых и кальциевых каналов. Предполагается, что сегмент 4 обладает вольтаж-сенсорной функцией и в каждом третьем или четвертом положении этого сегмента присутствует основная аминокислота. Отдельные каналы высококонсервативны. Кроме того, в различных ионных каналах также присутствуют консервативные районы, что является признаком их эволюционно родственного происхождения.

Рис. 19. Структура трансмембранных вольтаж-зависимых ионных           каналов

Характерным для генов ионных каналов является то, что мутации, затрагивающие разные участки этих белков, могут приводить к такому различному течению заболеваний, что клинически они могут быть отнесены к разным нозологическим формам. Так, разные мутации в одном и том же гене, кодирующем альфа-субъединицу мышечного натриевого канала, могут быть причиной развития семи клинически самостоятельных форм гипери гипокалиемической пароксизмальной миоплегии, парамиотонии и мио-

тонии.

Это в полной мере относится и к генам кальциевых каналов. Мутации в гене альфа-субъединицы кальциевого канала скелетных мышц являются причиной развития гипокалиемического периодического паралича. В то же время разные мутации в гене альфа1 А-субъединицы нейронального Са2+-канала P/Q-типа могут реализоваться в виде таких разных заболеваний, как спиноцеребеллярная атаксия типа 6, наследственная эпизодическая атаксия и семейная гемиплегическая мигрень.

168

2.2. Миотонические синдромы

а) Миотоническая дистрофия (MIM: 160900)

1. Клиническая характеристика заболевания

Клиническая картина миотонической дистрофии представляет собой сочетание миотонии, миопатии, сердечнососудистых нарушений и эндокринно-вегетативных расстройств. Начало заболевания относится к детскому возрасту, хотя более типичен дебют на втором-третьем десятилетии жизни. Первая клиническая симптоматика определяется признаками миотонического спазма и затруднения разгибания пальцев рук при резких, быстрых движениях. Симптом миотонического «ровика», обусловленный повышенной механической возбудимостью, легче получить на дельтовидной, икроножной и мышцах языка. Течение болезни неуклонно прогрессирующее. На фоне усиливающегося миотонического синдрома развивается мышечная слабость и атрофические проявления, сходные с миопатиями. Однако, в отличие от последних, формула распределения мышечной слабости иная. Слабеют мышцы лица, в частности круговая мышца глаза, мышца, поднимающая веко, жевательные мышцы, а также сгибатели шеи, плечелучевая и перонеальная на конечностях. Атрофии мышц ладоней приводят к своеобразной «обезьяньей лапе». Мышечная слабость и атрофии возникают одновременно. Постепенно из-за снижения мышечной силы миотонический синдром становится менее ярким. Глубокие рефлексы постепенно снижаются и в дальнейшем угасают. Достаточно типично наличие катаракты, та или иная степень интеллектуальной недостаточности. Нередко миотонической

дистрофии сопутствуют различные эндокринные и вегетативные нарушения.

В разных популяциях заболевание встречается с частотой 1 на 8—40 тысяч, наследуется по аутосомно-доминантному типу и характеризуется высокой пенетрантностью мутантных аллелей и феноменом антиципации — более ран-

 

ним началом и нарастанием тяжести симптомов заболевания в семье в последующих поколениях. Мужчины болеют в

три раза чаще женщин.

2. Картирование и идентификация гена DM

Ген миотонческой дистрофии DM (dystrophia myotonica) — один из первых аутосомных генов человека,

для которого методами генетического анализа была идентифицирована группа сцепления (Eiberg et al., 1983; O’Brien et al., 1983). Он расположен в области 19q13.2-q13.3 и его ближайшими проксимальными маркерами являются гены аполипопротеина С2 (АРОС2) и мышечной креатинкиназы

(СКММ) (Harley et al., 1991). Микросателлитный маркер D19S63 наиболее информативен для проведения пренатальной и досимптоматической диагностики миотонической дистрофии (Cobo et al., 1992). Ген миотонческой дистрофии состоит из 15 экзонов, распределенных на площади в 13 кб геномной ДНК. Эта область ДНК полностью просеквенирована (Shaw et al., 1993; Mahadevan et al., 1993). Ген DM активно экспрессируется во всех типах мышечных клеток, а также в других тканях, дефектных при миотонической дистрофии, в частности в мозге и в сердце. Обнаружено несколько различных изоформ мРНК гена DM в мышцах плода и новорожденных, что доказывает возможность альтернативного сплай­

синга первичного РНК-транскрипта.

3. Молекулярная природа мутаций в гене DM

Как мы уже отмечали, миотоническая дистрофия относится к группе так называемых болезней экспансии, так как в подавляющем большинстве случаев молекулярной основой заболевания служат значительные экспансии числа копий тринуклеотидного CTG-повтора, расположенного в З’-нетранслируемой части гена DM. Впервые предположение о молекулярных основах заболевания было высказано после обнаружения у больных с миотонической дистрофией необычного рестрикционного EcoRI-фрагмента, гибридизующегося с одним из геномных ДНК-зондов, изолированных из области локализации гена DM (Harley et al., 1992). При проведении с использованием этого зонда блот гибридизации по Саузерну в норме обнаруживаются два рестрикционных фрагментам

то время как у большинства пациентов один из этих фрагментов замещен на более крупный. Размеры этого необычного фрагмента могут варьировать у разных пациентов и даже в тех случаях, когда больные принадлежат одной семье. Наблюдается достоверная положительная корреляция между тяжестью течения, а также более ранним началом заболевания и длиной этого фрагмента. Одновременно методами позиционного клонирования был идентифицирован микросателлитный CTG-повтор, локализованный в З’-нетранслируемой области гена DM. Длина этого повтора оказалась значительно больше у больных с миотонической дистрофией (Brook et al., 1992). Этот повтор при рестрикции геномной ДНК эндонуклеазой EcoRI попадал именно в тот из фрагментов, гибридизующихся с использованным ДНК-зондом, длина которого оказывалась большей у больных. Таким образом, была расшифрована природа необычного рестрикционного EcoRIфрагмента.

Изолированный CTG-повтор в популяции также отличается крайней нестабильностью — количество копий в кластере варьирует от 5 до 30—37 При этом для многих популяций характерен двухвершинный характер распределения аллелей. Так, в отечественных популяциях доминируют аллели с 5 (42.5%) и с 11—13 (37%) повторами (Малышева и др., 1998). Однако у больных с миотонической дистрофией минимальное количество триплетов значительно больше и состав­

ляет не менее 50 при наиболее мягких формах болезни, от 100 до 1000 у пациентов с классическим течением и с дебютом во взрослом возрасте, в то время как при врожденных формах заболевания количество CTG-триплетов может достигать трех тысяч.

Определение размера CTG-повтора методами ПЦР или блот-гибридизации по Саузерну позволяет проводить прямую молекулярную диагностику миотонической дистрофии. Око­

ло 90% хромосом с экспансированными CTG-повторами в отечественных популяциях имеют одинаковый гаплотип по двум внутригенным полиморфным сайтам рестрикции. Этот же гаплотип характерен для 9 1 % хромосом с CTG(5) и для подавляющего большинста хромосом с CTG(15) (Малышева и др., 1998). Интересно отметить, что транскрибируемый нестабильный CTG-(5-30) мотив в З’-нетранслируемой области гена DM обнаружен только в геноме человека, несмотря на

то что фланкирующие нуклеотиды присутствуют в гомологичном гене мыши.

Недавно в геноме человека был идентифицирован еще один нестабильный патогенетический транскрибируемый, но не транслируемый CTG-повтор (Koob et al., 1999). Этот повтор расположен в области 13q21, и его экспансия является причиной развития одной из генетических форм спиноцеребеллярной атаксии (SCA8). Это неожиданная находка, так как до сих пор все доминантные спиноцеребеллярные атаксии были связаны с экспансиями CAG-повторов, кодирующих полиглютаминовые треки, входящие в состав различных белков. Удлиненные полиглютаминовые треки способны избирательно индуцировать образование устойчивых к протеолизу ядерных агрегатов в определенных типах нейронанальных клеток, чаще всего в клетках Пуркинье мозжечка. Накопление подобных ядерных включений оказывает цитотоксический эффект и является причиной развития специфических нейродегенеративных процессов, приводящих к различным формам спиноцеребеллярных атаксий. Очевидно, что патогенетический механизм действия экспансированного нетранслируемого CTG-повтора при форме 8 спиноцеребеллярной атаксии совершенно иной и он, по-видимому, сходен с механизмом действия таких же динамических мутаций при миотонической дистрофии. Для этих двух заболеваний характерен сопоставимый уровень экспансий CTG-повтора и очень высокая митотическая и мейотическая нестабильность экспансированных повторов, особенно заметная при прохождении мутантного аллеля через женский гаметогенез. Эти особенности отличают форму 8 от других типов спиноцеребеллярных атаксий. Различия в фенотипических проявлениях экспансий CTG-повторов, приводящих к таким клинически разным заболеваниям, как миотоническая дистрофия и спиноцеребеллярная атаксия, обусловлены особенностями функционирования тех генов, работа которых нарушается вследствие возникновения этих мутаций.

4. Механизмы экспансии CTG-повтора в гене DM

Итак, мутационным механизмом миотонической дистрофии является амплификация CTG-повтора в З’-нетранслируемой области гена DM. По-видимому, начальным предрасполагающим к мутационному событию фактором служит переход от аллеля с пятью CTG-повторами к аллелям, состоящим из 19—30 триплетов. Популяционная частота этого гетерогенного класса аллелей — (CTG)-19—30 — достигает 10% и, по-видимому, эти аллели составляют резерв для повторных мутаций. У больных отмечается также черезвычайно высокая соматическая нестабильность CTG-повтора (Ashizawa et al., 1993), что согласуется сданными о различном характере экспансии у некоторых однояйцовых близнецов (Fu et al., 1992). В эмбриональном периоде подобная нестабильность особенно заметна между 13 и 16 неделями беременности. Наибольшая экспансия характерна для сердечной мышцы, при этом степень гетерогенности не коррелирует с начальной величиной экспансированного CTG-повтора (Martorell et al., 1995). В отличие от мышц, в клетках перифирической крови больных наблюдается большая нестабильность (CTG)-noвтора в сторону его экспансии (Martorell et al., 1995). Дальнейший анализ нестабильности CTG-повтора, проведенный на протяжении 1—7 лет на клетках крови 111 пациентов с варьирующим течением миотонической дистрофии, показал прямую зависимость уровня гетерогенности от времени и начальной длины повтора (Martorell et al., 1995). Не исключено, что определенный вклад в формирование соматического мозаицизма вносят индивидуальные генетические факторы, а также факторы окружающей среды.

Хорошо прослеживаемой клинической особенностью болезней экспансии, и в частности миотонической дистрофии, является антиципация. Расшифрована молекулярная природа этого явления. Оказалось, что аллели, связанные с относительно небольшими экспансиями CTG-повтора, при которых отсутствуют или наблюдаются лишь слабые клинические проявления заболевания, обладают высокой мейотической нестабильностью. Их прохождение через гаметогенез сопровождается дальнейшим значительным нарастанием числа триплетов в нестабильных повторах и в следствие этого более резким снижением функции соответствующего гена (Buxton et al., 1992). Еще одной особенностью наследования бопезней экспансии является геномный импринтинг — разное течение заболевания в зависимости от того, получил больной мутантный аллель от матери или от отца. Так, при миотонической дистрофии амплификация CTG-области встречается в материнском гаметогенезе значительно чаще, чем в отцовском. Это особенно справедливо для тяжелых врожденных форм заболевания.

В опытах in vitro с использованием геномных клонов, содержащих локус DM с экспансированными CTG-повторами, исследовали роль одного из ключевых ферментов репарации — мутазы S2 (продукта гена MSH2), в нестабильности

тринуклеотидных повторов, ответственных за целый ряд тяжелых нейродегенеративных болезней (Pearson et al., 1997). Оказалось, что мутаза S2 способна специфическим образом связываться со структурами, образованными смещением комплементарных нитей ДНК в области локализации таких повторов и, таким образом, может принимать участие в их экспансии.

5. Биохимическая характеристика продукта гена DM

Ген миотонической дистрофии кодирует белок, получивший название миотонин-протеинкиназы — Mt-PK, и поэтому ген DM обозначается иногда как DMPK (dystrophia myotonica

grotein kinase). Этот белок (Mt-PK), состоящий из 624 аминокислот, относится к семейству серин/треонин протеинкиназ, родственных цАМФ-зависимым протеинкиназам (Fu et al., 1992). Молекулярный вес полноразмерной изоформы Mt-PK, транслируемой с первого AUG-кодона гена DMPK, составляет 72 кД (Timchenko et al., 1995). Наиболее консервативен каталитический домен этого белка, содержащий специфическую киназную и нуклеотид-связывающую конценсусные последовательности. Значительно менее консервативен большой N-терминальный домен. Промежуточный домен с высоким содержанием альфа-спиралей имеет небольшое сходство с филаментными белками. По-видимому, миотонин-про-

теинкиназа, подобно другим протеинкиназам данного типа, играет критическую роль в регуляции клеточной дифференцировки и в репликации ДНК, а сам ген DMPK имеет функции рецессивного супрессора опухолей. Это согласуется с

данными о повышенной частоте у пациентов с миотонической дистрофией пиломатриксом (опухолей тканей, производных нервного гребня), паратиреоидных аденом и небольших карцином кишечника (Harris et al., 1996).

С использованием набора моноклональных антител на каталитический и альфа-спиральный домены Mt-PK в скелетных мышцах человека обнаружены три изоформы миотонинпротеинкиназы — основная с м.в. 55 кД и минорные с м. в.72 и 80 кД (Pham et al., 1998). 5 типов антител на каталитический и 5 на альфа-спиральный домены идентифицировали только минорные изоформы, причем 72-кД белок присутствовал во всех исследованных тканях, тогда как 80-кД изоформа белка с варьирующей экспрессивностью обнаруживалась главным образом в скелетных мышцах и в интеркалярных

дисках сердечной мышцы. Два типа моноклональных антител на каталитический домен обнаруживали только мажорную 55-кД изоформу белка, присутствующую исключительно в скелетных мышцах. Ни один из типов моноклональных антител не подтвердил ко-локализации Mt-PK с ацетилхолиновыми рецепторами в нейромышечных соединениях. Методами субклеточного фракционирования и седиментационного анализа показано, что основная часть Mt-PK в скелетных мышцах и в мозге имеет цитозольную локализацию.

6. Молекулярные основы патогенеза миотонической дистрофии

У больных, по крайней мере со взрослой формой заболевания, наблюдается уменьшение экспрессии гена DMPK как на уровне мРНК, так и на белковом уровне (Fu et al., 1993). В опытах, проведенных на культурах клеток, показано, что в соматических гибридах, содержащих 19-ю хромосому с экспансированным CTG-повтором, снижен синтез первичного РНК-транскрипта гена DMPK и нарушен его процессинг (Carango et al., 1993). Наиболее вероятным представляется, что экспансия CTG-повтора влияет не на транскрипцию как таковую, а на посттранскрипционную модификацию мРНК гена DMPK. Обнаружение повышенных уровней удлиненных транскриптов гена DMPK в ядрах клеток пациентов с миотонической дистрофией позволяет предполагать возможность нарушения каких-то этапов процессинга мутантного первичного РНК-транскрипта, таких как полиаденилирование или транспорт мРНК из ядра в цитоплазму (Wang et al., 1995b; Taneja et al., 1995). Доминантный характер наследования миотонической дистрофии, по-видимому, связан с дефици­

том дозы зрелого продукта гена DMPK. Не исключено, что повышение количества или активности миотонин-протеинкиназы может оказывать терапевтический эффект на взрослых пациентов. Однако в целом данные по влиянию экспансированного CTG-повтора на экспрессию гена DMPK носят противоречивый характер.

Более привлекательной кажется другая гипотеза, касающаяся молекулярных механизмов патогенного действия

динамических мутаций при миотонической дистрофии. Показано, что экспансированные CTG-повторы формируют наиболее сильные из известных естественных элементов укладки нуклеосом (Wang, Griffith, 1995). При этом эффективность образования нуклеосом возрастает с увеличением длины повтора. Можно предположить, что экспансированные блоки повторов способны менять локальную структуру хромосом, что, в свою очередь, может сопровождаться нарушением экспрессии DMPK и/или других близко расположенных генов. Это предположение нашло экспериментальное подтверждение. Так, недалеко от CTG-повтора была идентифицирована последовательность, гиперчувствительная к действию ДНКазы I. При обработке ДНКазой I нормальной ДНК в этом сайте происходит разрыв. Однако мутантные после­

довательности ДНК с большими экспансированными CTGповторами оказываются устойчивы к действию фермента (Often, Tapscott, 1995). Наиболее простым объяснением данного феномена является то, что увеличение длины CTG-повтора в гене DMPK нарушает локальную структуру хроматина, вследствие чего этот гиперчувствительный сайт становится недоступен для действия ДНКазы I. Предложены и некоторые другие гипотезы для объяснения механизма повреж­

дающего действия экспансированного CTG-повтора.

В опытах in vitro идентифицирована группа белков, способных специфически связываться с CTG-повторами, нахо­

дящимися как в однонитевой, так и в двунитевой форме (Yano

Yanagisawa et al., 1995; Richards et al., 1993; Timchenko et al., 1996). При этом белки, связывающиеся с двунитевыми зондами, имеют, как правило, ядерную локализацию. Кроме того, обнаружен цитоплазматический белок, специфически взаимодействующий с РНКовыми CUG-триплетами — CUG-BP (Timchenko et al., 1996). Возможно, именно этот белок вовлечен в патогенез миотонической дистрофии.

Несмотря на значительные успехи в расшифровке природы мутаций при миотонической дистрофии, остается неясным, происходит ли дисфункция или приобретение новой функции гена DMPK на уровне взаимодействия ДНК со структурой хроматина и/или на уровне регуляции процессинга пер­

вичного РНК-транскрипта. По-видимому, в разных тканях

12 Заказ № 170

определяющими могут быть различные нарушения, которые в комплексе и формируют плейотропный фенотип заболевания.

7. Характеристика других генов, участвующих в патогенезе миотонической дистрофии

Сложность клинического фенотипа миотонической дистрофии в сочетании с противоречивыми данными, касающимися действия GTG-экспансии на экспрессию DMPK локуса, привели к необходимости исследования соседних генов, которые могут быть вовлечены в этиологию заболевания. Область локализации гена DMPK насыщена активно транскрибирующимися последовательностями. У человека, так же как и у мыши, в непосредственной близости от гена DMPK в проксимальной области расположен активный ген — DMR-N9, обозначаемый иногда геном 59 — рис. 20 (Jansen et al., 1992; Jansen et al., 1995). Этот ген экспрессируется главным образом в мозге и в testis. Функция белкового продукта DMR-N9 неизвестна. Высказано предположение, что экспансия CTG-повтора влияет на аль­

тернативную экспрессию генов DMPK и DMR-N9.

Рис. 20. Структурная организация DM-района

Более вероятным представляется участие в контроле миотонической дистрофии гена DMAHP (dystrophia myotonica associated homeodomain protein) (или STX5), pacположенного в непосредственной близости с З’-конца от DMPK и кодирующего так называемый DM-ассоциированный гомеодоменный белок. DMAHP экспрессируется во многих типах тканей, включая скелетные мышцы, фибробласты, лимфоциты, сердце и мозг. Известно, что родственные гомеодоменные белки дрозофилы являются транскрипционными факторами, регулирующими экспрессию генов как на транскрипционном уровне, так и на уровне трансляции посредством их связывания с ДНК и/или с РНК соответственно. CTG-повтор локализован внутри CpG-ocтровка в З’-нетранслируемой области гена DMPK, и не исключено, что разрушение этого элемента за счет экспансии повтора может нарушать экспрессию ассоциированного с этим островком гена(ов). Ранее идентифицированный гиперчувствительный сайт для ДНКазы I почти целиком расположен в промоторной области этого гена и изменения в этом сайте, вызванные экспансией CTG-повтора, могут изменять экспрессию DMAHP. Это предположение было подтверждено при обнаружении в этом сайте энхансера, регулирующего транскрипцию DMAHP (Klesert et al., 1997). При анализе экспрессии DMAHP в клетках пациентов с миотонической дистрофией, в которых отсутствует гиперчувствительный сайт ДНКазы I, обнаружено 2—4-кратное снижение устойчивых DMAHP-транскриптов по сравнению с контролем, причем уровень снижения коррелирует с длиной экспансированного повтора. Не исключено, что нарушение работы двух соседних генов DMPK и DMAHP формирует сложный фенотип миотонической дистрофии.

8. Модельные линии животных

Предположение об участии нескольких соседних генов в контроле миотонической дистрофии согласуется с данными по трансгенному разрушению гомологичного гена Dmpk у мышей. У нулевых мутантов ( Dmpk(-/-)) 72-кД изоформа миотонин-протеинкиназы полностью отсутствует. У таких животных в позднем возрасте развивается прогрессирующая миодистрофия с патологическими чертами, сходными с теми, которые характерны для пациентов с мягким течением миотонической дистрофии (Jansen et al., 1996; Reddy et al., 1996). У взрослых особей наблюдаются ультраструктурные изменения в мышцах, варьирующая величина мышечных волокон, с повышенной частотой дегенерации и фиброзов. Частота дегенерирующих волокон у взрослых мутантов повышена на 50% по сравнению с молодыми животными. У мышей с гиперэкспрессией DM-npoтеинкиназы, полученных путем трансгеноза нормального гена DMPK человека в ранние зародыши Dmpk(-/-) мутантов, развивается изолированная гипертрофическая кардиомиопатия, несмотря на то что 72-кД изоформа миотонинпротеинкиназы присутствует в большом количестве. Однако во всех подобных моделях отсутствуют ведущие симптомы миотонической дистрофии, включая атрофию мышечных волокон, миотонию, катаракту и мужское бесплодие. Эти результаты показывают, что продукт гена DMPK необходим для поддержания нормальной структуры и функционирования скелетных мышц. Однако инактивация или изменение характера экспрессии DMPK-гена не являются единственными критическими условиями, необходимыми

для развития заболевания.

В опытах на трансгенных животных показано, что введение геномных областей, содержащих районы DM локуса человека с экспансированным CTG-повтором, не приво­

дит к фенотипу, сходному с миотонической дистрофией. Однако в соматических и зародышевых клетках трансгенных мышей наблюдается гипермутабильность введенного повтора как в сторону экспансий, так и в сторону делеций (Gourdon et al., 1997; Monckton et al., 1997). При этом нестабильность была умеренной при введении 45-кб конструкции, включающей наряду с мутантным геном DMPK с

55 CTG-повторами два фланкирующих гена — DMR-N9 и DMAHP. Значительно более выраженная мутабильность наблюдалась в трансгенных линиях мышей, полученных в результате введения в ранние зародыши З’-нетранслируемой области DMPK с более длинным повтором, состоящим из 162 триплетов. Для этих линий характерны также эффекты, связанные с родительской передачей мутантного аллеля и нарушением сегрегации. Половые и межлинейные различия в мутационной активности указывают на существование в геноме человека dsn trans-действующих генетических элементов, модулирующих устойчивость этой области. Показано, что соматическая нестабильность CTGповтора увеличивается с возрастом трансгенных животных, но не зависит от тканеспецифического уровня транскрипции любого из трех генов — Dmahp, Dmpk и Dmr-n9, а

также не зависит от пролиферативной способности различ­

ных тканей (Lia et al., 1998).

b) Врожденная миотония Томсена (MIM: 160800), болезнь Беккера (MIM: 255700)

Врожденная миотония Томсена — относительно редкое заболевание, встречающееся с частотой 0.3—0.7 на 100 000. Начальные симптомы болезни могут относиться как к раннему детству (1—3 года), так и к школьному возрасту (8—10 лет). Нередко начальные признаки болезни просматриваются родителями ребенка, так как он не всегда может ощутить недостаток своей моторики. К ранним симптомам относится болезненное сведение икроножных мышц при охлаждении и мышечной нагрузке. Первыми страдают мышцы нижних конечностей, затем к ним присоединяются верхние, могут вовлекаться в процесс жевательные мышцы, мышцы языка, шеи. Весьма специфичен симп­

том повышенной мышечной механической возбудимости: миотонический «ровик», который возникает в мышце при нанесении удара молоточком. Особенно хорошо феномен «ровика» выражен при ударе молоточком по мышцам языка. Своеобразен внешний вид больного, обусловленный хорошо развитой мышечной системой, что придает телосложению черты атлетического. При этом у больных определяется мышечная слабость. Сухожильные рефлексы обычно снижены, может наблюдаться их миотоническая характеристика. Течение заболевания медленно прогрессирующее. Больные приспосабливаются к своему дефекту и при правильной профессиональной ориентации приобретают специальность и социально адаптируются. Витальный прогноз благоприятный.

Врожденная миотония включает аутосомно-доминантную форму — болезнь Томсена, и аутосомно-рецессивную форму — болезнь Беккера. Согласно классификации Беккера, выделяют пять различных типов доминантных миотоний (Becker, 1977). Тип I — классическая болезнь Томсена. Тип II характеризуется мышечными болями и флюктуирующим течением. При типе III заметна миотоническая чувствительность к холоду, особенно круговой мышцы глаза и круговой мышцы рта. Эта форма отличается от врожденной парамиотонии отсутствием холод-индуцируемого паралича. Тип IV характеризуется промежуточным течением и меньшей вовлеченностью мышц лица. Тип V — изолированная перкуссионная миотония языка. Считается, что рецессивная форма врожденной миотоний — болезнь Беккера, встречается чаще и протекает тяжелее, чем форма Томсена. Как правило, эта форма диагностируется в возрасте 4—12 лет, причем у мальчиков еще позднее — до 18 лет. Болезнь дебютирует с поражения мышц нижних конечностей, достигая через несколько лет верхних конечностей, мышц лица, включая жевательную мускулатуру. Чувствительность по отношению к холоду менее выражена, чем при доминантной форме заболевания.

Описание генетической линии мышей ard, являющейся естественной моделью врожденной миотоний, способствовало идентификации гена человека, ответственного за миотонию Томсена. Оказалось, что у мутантных мышей отсутствует мембранный белок мышц, выполняющий функции хлорного канала. Примечательно, что и у пациентов с врожденной миотонией значительно снижена хлорная проводимость в сарколемме биоптатов межреберных мышц.

Ген, кодирующий главный хлорный канал скелетных мышц млекопитающих, был клонирован в 1991 году (Steinmeyer et al., 1991а). У мышей ген хлорного канала С1с-1 локализован в хромосоме 6 в районе, синтенном области 7q31q35 генома человека. Показано, что в линии ard произошло разрушение мышиного гена С1с-1 в результате внедрения в кодирующую область транспозоно-подобного элемента семейства ETn (Steinmeyer et al., 1991b). Таким образом, было доказано, что дефект хлорного канала мышц является первичным в патогенезе данной формы миотонии у мышей. Вслед за этим, по гомологии с геном главного хлорного канала скелетных мышц крысы, из экспрессионной библиотеки мышц человека был изолирован кДНКовый клон, содержащий около 80% кодирующей последовательности соответствующего гена человека — CLC1 (С! channel 1) (Koch et al., 1992). Методом соматической гибридизации ген CLC1 был картирован в области 7q32-qter.

С учетом описанных выше обстоятельств был выполнен анализ сцепления врожденной миотонии в семьях с

доминантной и рецессивной формами заболевания с высокополиморфными динуклеотидными повторами гена Тклеточного рецептора В (TCRB), локализованного в длинном плече хромосомы 7 (Adballa et al., 1992). Оказалось, что оба мутантных гена THD (Thomsen disease) и MCR

(myotonia congenita, recessive), ответственных за форму Томсена и Беккера соответственно, картируются в том же районе 7q31, где расположен гена муковисцидоза — CFTR. Ген CFTR кодирует белок, также являющийся хлорным каналом. Этот белок участвует в регуляции хлорного потока через апикальные мембраны эпителиальных клеток. Однако было показано, что миотония Томсена и Беккера не связаны с мутациями в гене CFTR. Этот ген расположен по отношению к генам THD и MCR на расстоянии более 24 сМ. В настоящее время можно считать доказанным, что обе формы заболевания являются аллельными вариантами и обусловлены мутациями в гене хлорного канала скелетных мышц — CLC1. При рецессивных формах функция этого хлорного канала полностью иьактивирована. Доминантный эффект мутаций при болезни Томсена обьясняется гомомультимерной структурой канала, при которой субъединица, кодируемая мутантным аллелем, связывается с функциональной субъединицей, кодируемой нормальным аллелем, и таким образом ее инактивирует.

В 15% хромосом пациентов с болезнью Беккера обнаруживается миссенс-мутация в гене CLC1, вызванная T-G трансверсией и сопровождающаяся заменой фенилаланина на цистеин в трансмембранном домене D8 хлорного канала. Эта мутация может быть легко диагностирована методом рестрикционного анализа (Koch et al., 1993). Описаны и другие рецессивные миссенс-мутации в гене

CLC1 — V236L, G285E, I556N (Kubisch et al., 1998). При болезни Томсена также были идентифицированы миссенсмутации в гене CLC1. Первая из HVX — G-A транзиция, сопровождающаяся заменой глицина на глютаминовую кислоту в 180 позиции белка (George et al. 1993). Во всех известных белках, функционирующих как хлорные каналы, положение этого глицина консервативно, что указывает на его функциональную значимость. Затем была описана целая серия других доминантных миссенс-мутации — V286A, F307S, А313Т (Kubisch et al., 1998).

Анализ экспрессии мутаций на модельной системе Xenopus показал, что доминантные мутации сдвигают вольтаж-зависимость хлорного канала в сторону положительных потенциалов. Подобный сдвиг сохраняется и для гетеромерных каналов, образующихся из мутантных и нормальных субъединиц и присутствующих у пациентов с болезнью Томсена. Этим и объясняется доминантно-негативный эффект подобных мутаций. Рецессивные мутации также сдвигают чувствительность хлорного канала в сторону положительных значений. Однако в этом случае при ко-экспрессии в системе in vitro мутантных и нормальных аллелей гена CLC1 подобного сдвига в работе хлорных каналов не наблюдается. Таким образом, вольтаж-зависимость гетеромерных хлорных каналов далеко не всегда занимает промежуточное положение между значениями, характерными для соответствующих гомомерных каналов, и это хорошо коррелирует с уровнем пенетрантности и характером наследования различных форм врожденных миотонии.

2.3. Периодические параличи

Периодические параличи представляют собой группу наследственных заболеваний, обусловленных мутациями в генах вольтаж-зависимых ионных каналов.

а) Периодический паралич II, гиперкалиемического типа (MIM: 170500; 168300; 168350; 170600)

Гиперкалиемическая форма пароксизмальной миоплегии возникает при повышении уровня сывороточного калия. Начало заболевания относится к первому пятилетию жизни. Приступам мышечной слабости могут предшествовать ощущения тяжести в конечностях. Пароксизм миоплегии развивается в течение нескольких минут и длится на протяжении 30 минут. Более продолжительные приступы встречаются редко. В миоплегический синдром может включаться мимическая и артикуляционная мускулатура. В отличие от гипокалиемического пароксизма, при гиперкалиемическом приступы возникают днем. Голодание, переохлаждение, физическое переутомление способствуют возникновению миоплегии. Провоцировать приступ может прием внутрь раствора хлористого калия. В редких случаях уровень экстраклеточного калия поднимается настолько высоко, что могут возникнуть кардиологические проблемы. Частота приступов снижается у пациентов, достигших 35—40-летнего возраста. Выделяют три типа адинамического эпизода: в комбинации с миотонией, без каких-либо признаков миотонии и в комбинации с парамиотонией. Ранее последнюю форму обозначали в качестве самостоятельной нозологической единицы — врожденной парамиотонии Эйленбурга. В тяжелых случаях продолжительность эпизодов параличей может достигать нескольких месяцев. При снижении частоты параличей наблюдается тенденция к прогрессирующей миопатии.

В опытах in vitro было показано, что небольшое увеличение содержания внеклеточного калия может оказывать

триггерный эффект на тетродотоксин-чувствительный натриевый канал в дефектных мышцах больных, страдающих гиперкалиемическими параличами в сочетании с миотонией (Lehmann-Horn et al., 1987). В норме эти концентрации калия могут быть недостаточны для переключения канала. Ген альфа-субъединицы мышечного натриевого канала взрослых SCN4A— (sodium channel 4 alpha) картирован в длинном плече хромосомы 17 в области 17q23.1-q25.3 (Fontaine etal., 1990; George et al., 1991). Он распределен на площади в 35 кб геномной ДНК и кодирует белок размером в 1836 аминокислот (Wang et al., 1992; George et al., 1992).

При генетическом анализе семей с гиперкалиемическими параличами было показано тесное сцепление, а чаще полное отсутствие рекомбинации, между мутантным геном HYPP (hyperkalemic geriodic paralysis) и ДНК-маркерами, расположенными в непосредственной близости или внутри гена SCN4A(Ptacek et al., 1991; 1992; Koch et al., 1991; McClatchey et al., 1992). Подтверждением того, что гиперкалиемические периодические параличи и врожденная парамиотония Эйленбурга являются аллельными заболеваниями, обусловленными генетическими нарушениями работы натриевого канала мышц, явилась молекулярная идентификация мутаций в гене SCN4A. В настоящее время у пациентов с гиперкалиемическими параличами иден­

тифицированы 4 различные миссенс-мутации в гене SCN4A, две из которых — Т704М и M1592V, по-видимому, являются мажорными (Ptaceketal., 1991; McClatchey et al., 1992; Feero et al., 1993). Кроме того, описано 10 миссенсмутации у пациентов с парамиотонией Эйленбурга и все они приводят к заменам аминокислот либо в четвертом домене белка, либо в области между шестым сегментом третьего домена и четвертым доменом (Lehmann-Horn et al., 1993). Интересно отметить, что мутации в гене SCN4A, идентифицированные при холод-индуцируемой врожденной парамиотонии, являются первыми температур-чувствительными мутациями у человека, описанными на молекулярном уровне.

Врожденную парамиотонию без холод-индуцируемых параличей также выделяли раньше в самостоятельную группу. Однако обнаружение у подобных пациентов из Германии однотипной миссенс-мутации в гене SCN4A—V1293I явилось доказательством аллельной природы данной формы заболевания, парамиотонии Эйленбурга и гиперкалиемической пароксизмальной миоплегии (Koch et al., 1995). Аллельными вариантами являются также атипичные не холод-индуцируемые миотонии — флюктуирующая, перманентная и ацетозольамид-чувствительная, так как при каждом из этих заболеваний описаны различные миссенс-мутации в гене SCN4A. Недавно показано, что некоторые формы гипокалиемических периодических параличей также могут быть аллельными вариантами гиперкалиемической пароксизмальной миоплегии (Bulman, 1997). Таким образом, различные мутации в одном и том же гене SCN4A могут быть причиной развития семи клинически самостоятельных форм гипери гипокалиемической пароксизмальной миоплегии, парамиотонии и миотонии. На рис. 21 показана локализация идентифицированных у пациентов с перечисленными выше типами заболеваний миссенс-мутаций в гене SCN4A, приводящих к аминокислотным заменам в различных доменах натриевого канала мышц. Молекулярный анализ причин наблюдаемой фенотипической изменчивости является основой для физиологического анализа функционирования данного ионного канала.

Рис. 21. Распределение мутаций в альфа-субъединице натриевого канала скелетных мышц при различных формах наследственных параличей и парамиотоний

Имеется аутентичная модель гиперкалиемического периодического паралича на определенной породе лоша­

дей (Quarter), одним из определяющих свойств которых является гипертрофия мускулатуры. При этом описана миссенс-мутация в гомологичном гене натриевого канала мышц, частота которой среди данной породы лошадей достигает 30% (Rudolph et al., 1992).

б) Периодический паралич I, гипокалиемического типа (MIM: 170400)

Наиболее часто встречается гипокалиемическая пароксизмальная миоплегия или гипокалиемический перио­

дический паралич. Начало заболевания колеблется от 3 до 20 лет, чаще это второе десятилетие жизни. Приступы миоплегии обычно возникают утром или ночью. Проснувшись, больной не в состоянии совершить активное движение. Реже плегия носит характер не общий, а гемипаретический, то есть имеет место очаговая слабость. Парезы носят признаки периферических. Снижается мышечный тонус, угасают глубокие рефлексы. Чувствительность не претерпевает каких-либо нарушений. Длительность миоплегии от нескольких часов до 3—4 суток. Сознание никогда не утрачивается. Выход из миоплегии происходит постепенно, начиная с дистальных отделов конечностей. В качестве факторов, провоцирующих пароксизм гипокалиемической миоплегии, называют прием обильной пищи, богатой углеводами, переохлаждение, физические нагрузки. Для мужчин характерна полная пенетрантность, тогда как вероятность проявления заболевания у женщин составляет лишь 50%.

Анализ сцепления мутантного гена с микросателлитными ДНК-маркерами, проведенный в семьях различного этнического происхождения с гипокалиемическим перио­

дическим параличом, позволил локализовать ген НОКРР (hypokalemic periodic garalysis) в длинном плече хромосомы 1 в области 1q31-q32 (Fontaine et al., 1994). В этой же районе расположен ген CACNL1 A3 (Са cannal, type LJ_, alpha 3), кодирующий альфа-субъединицу дигидропиридин-чувствительного кальциевого канала скелетных мышц. Предположение об идентичности генов НОКРР и CACNL1A3 нашло подтверждение при обнаружении у пациентов с гипокалиемической пароксизмальной миоплегией трех различных миссенс-мутаций в гене CACNL1A3 (Ptaceket al., 1994; Jurkat-Rott et al., 1994). Однако не во всех семьях с гипокалиемическим периодическим параличом прослеживается сцепление мутантного гена с маркерами длинного плеча хромосомы 1 (Plassart et al., 1994). Как уже указывалось, в одной из семей обнаружена новая миссенс-мутация в гене SCN4A, затрагивающая высококонсервативный остаток в вольтаж-чувствительном сегменте S4 альфа-субъ-

 

единицы натриевого канала скелетных мышц (Bulman, 1997). Таким образом, некоторые формы этого заболевания могут быть аллельными вариантами гиперкалиемической пароксизмальной миоплегии. в) Периодический паралич III, нормокалиемического типа (MIM: 170600)

Нормокалиемическая форма миоплегии начинается в первом десятилетии жизни. Тяжесть миоплегического пароксизма весьма вариабельна, включение при пароксизме жевательной и мимической мускулатуры непостоянно. Уровень калия в сыворотке крови во время приступа миоплегии, до и после него не отклоняется от нормы. Клиническая картина характеризуется довольно типичными миоплегическими пароксизмами, длительность которых составляет от нескольких часов до нескольких недель. При электронно-микроскопическом анализе скелетных мышц больных наблюдается расширение саркоплазматического ретикулума. Данная форма является наиболее редкой. Наследуется заболевание по аутосомно-доминантному типу. Локализация мутантного гена пока неизвестна.

ГЛАВА 3

БОЛЕЗНИ С ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫМ

ПОРАЖЕНИЕМ ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО ДВИГАТЕЛЬНОГО НЕВРОНА

3.1. Общая характеристика

В данную группу заболеваний включены проксимальные детские спинальные амиотрофии, спинально-бульбарная мышечная атрофия позднего возраста, или болезнь Кеннеди, наследственные полинейропатии и боковой амиотрофический склероз. Общая молекулярно-генетическая характеристика этих болезней представлена в табл. 11.

Таблица 11 Молекулярно-генетическая            характеристика       болезней        с преимущественным          поражением   периферического

двигательного неврона

Нозологическая форма, MIM

Ген,

локализация

Белок, функции

Спинальная

SMN1

белок выживания

амиотрофия,

тип I, болезнь

Верднига-Гоффмана,

253300; тип II, хроническая,

253550;

тип III, болезнь

Кугельберга-Веландер,

253400

+

NAIP

двигательных

нейронов — белок РНП-комплекса, участвующий в метаболизме

и процессинге мРНК

+

ингибитор нейронального апоптоза

+

H4F5

5q12.2-q13

белок сплайсинга

Продолжение табл. 11

Спинально-бульбарная мышечная атрофия (болезнь Кеннеди); синдром тестикулярной феминизации, 313200

AR Xq11-q12

андрогеновый рецептор

Болезнь

Шарко-Мари-Тус тип 1 В, 118200;159440;

синдром

Дежерин-Сотта, 145900

СМТ1В,

MPZ,

МРР,

1q23-q25

главный структурный белок периферического миелина

Р(0)

Болезнь

Шарко-Мари-Тус тип IА, 118220; синдром

Дежерин-Сотта, 145900

СМТ1А,

РМР22

17р11.2

Ртр-22 — интефальный белок компактного миелина периферической нервной системы

Нейропатия наследственная со склонностью

к парезам, 162500

HNPP,

РМР22

17р11.2

периферический белок миелина 22

Болезнь

Шарко-Мари-Тус

Х-сцепленная,

302800; 304040

СМТХ1, СХ32

Xq13-q21

коннексин 32

Боковой амиотрофически склероз, 105400

ALS1,

SOD1

21q22.1-q22.2

Cu/Zn-супероксид-дизмутаза

Клинически выделяют три типа спинальной мышечной атрофии. Первый тип детской спинальной амиотрофии — болезнь Верднига-Гоффмана, II тип — хронический или промежуточный и III тип — болезнь Кугельберга-Веландер. Оказалось, что клинически гетерогенная группа проксимальных детских спинальных амиотрофии представляет собой аллельные варианты мутаций одного или, точнее, группы тесно сцепленных генов, локализованных в необычной чрезвычайно нестабильной области генома человека, получившей название SMA (spinal muscular atrophy) области. SMA-область в длинном плече хромосомы 5 размером около 850 кб характеризуется присутствием различных повторяющихся низкокопийных элементов, множественных копий отдельных генов, необычных экспрессируещихся интрон-содержащих псевдогенов, функциональные копии которых разбросаны по всему геному.

Около 93% больных со спинальной мышечной атрофией любого типа несут гомозиготные делеций в гене выживания двигательных нейронов — SMN1, расположенном в SMA-области. Остальные пациенты содержат подобные делеций в гетерозиготном состоянии, при этом в гомологичной хромосоме у них обнаруживаются либо сплайсинговые мутации, либо миссенс-мутации, локализованные, как правило, в З’-конце гена SMN1. Белок выживания двигательных нейронов присутствует в цитоплазме и в ядрах клеток, причем ядерная форма белка найдена в структурах, ассоциированных с гетерогенными ядерными рибонуклеопротеиновыми частицами, предположительно участвующими в метаболизме и процессинге мРНК. Мутантные формы белка утрачивают способность к олигомеризации.

Наличие гомозиготных делеций или повреждающих мутаций в SMN1 является необходимым, но недостаточным условием для развития болезни, так как в небольшом проценте случаев гомозиготные делеций в гене SMN1 присутствуют у асимптоматичных родственников больных. В непосредственной близости от SMN1 идентифицированы еще три гена, часто вовлекаемые в делеций у пациентов с различными формами спинальных амиотрофий. По-видимому, два из них имеют отношение к патогенезу заболевания. Это ген ингибитора нейронального апоптоза — NAIP — и ген H4F55. Продукт гена H4F55, так же как белок выживания двигательных нейронов, ко-локализован с малыми ядерными рибонуклеопротеиновыми комплексами, участвующими в процессе сплайсинга. Гены NAIPn H4F55 делетированы соответственно у 50% и у 90% больных с I типом заболевания. Нельзя исключить вклад в патогенез спинальной мышечной атрофии и экспрессирующегося гена SMN2, гомологичного SMN1 и также расположенного в SMA области.

Согласно современным представлениям, для развития спинальной мышечной атрофии необходима утрата или мутационное повреждение хотя бы в одном из трех генов SMN1, NAIP и H4F5. Болезнь возникает при гомозиготном состоянии мутаций (обычно — делеций) в гене SMN1, при этом различия между клиническими формами спинальной мышечной атрофии определяются тремя основными факторами: наличием или отсутствием гомозиготных делеций в генах NAIP и H4F5 (или иных мутаций, существование которых в настоящее время не может быть исключено) и числом центромерных копий гена SMN2 (две — в случае типа I и от трех до пяти — в случае болезни II и III типа).

По некоторым оценкам, до 30% взрослых форм спинальных мышечных атрофии не связаны с мутациями в SMA-области. Особенно отчетливо отсутствие такой связи прослеживается на аутосомно-доминантных вариантах заболевания. Среди них мышечная атрофия Шарко-Мари-Тус, обозначаемая также как дистальная наследственная моторная нейропатия типа II (MIM 158590). Ген НММ2,ответственный за это заболевание картирован в длинном плече хромосомы 12 в области 12q24e 13-сМ интервале между маркерами D12S86 и D12S340 (Timmerman et al., 1996).

К спинальным мышечным атрофиям позднего возраста относится болезнь Кеннеди — спинально-бульбарная мышечная атрофия. Это сцепленное с полом нейродегенеративное заболевание обусловленно увеличением длины микросателлитного CAG-повтора, расположенного в гене адренорецептора(АР) и кодирующего цепочку из полиглютаминов. Подробная молекулярно-генетическая характеристика подобных заболеваний, относящихся к группе болезней экспансии, будет представлена во второй части монографии. Для болезней, вызванных экспансией CAG-повтора, характерна медленно прогрессирующая деградация нейронов в специфических отделах мозга. Дегенеративным процессам предшествует накопление в ядрах нейронов нерастворимых устойчивых к протеолизу белковых агрегатов. Наличие подобных

 

ядерных и/или цитоплазматических включений доказано в отношении по крайней мере шести подобных заболеваний, включая спинально-бульбарную мышечную атрофию. Эти образования, состоящие из гранул и филамент, окрашиваются специфическими антителами только на те участки соответствующих белков, которые содержат полиглютаминовые

треки. По-видимому, процессинг мутантных белков при болезнях, вызванных экспансией CAG-повтора, сопровождается образованием укороченных фрагментов с удлиненными полиглютаминами, способных транспортироваться в ядра и накапливаться там в составе белковых агрегатов. Ядерные включения окрашиваются также антителами наубикитин, что доказывает их устойчивость к убикитин-опосредованному протеолизу. Накопление подобных агрегатов в нейрональных клетках индуцирует апоптоз и является одной из основных причин развития специфических нейродегенеративных процессов.

Наследственные полинейропатии включают в себя различные формы болезни Шарко-Мари-Тус и синдрома Дежерин-Сотта. Это большая генетически гетерогенная группа заболеваний со сходной клинической картиной. Перонеальная мышечная атрофия, — или болезнь Шарко-Мари-Тус, — наиболее распространенная наследственная периферическая нейропатия у человека. Известны аутосомно-доминантные, аутосомно-рецессивные и сцепленные с полом формы заболевания. Чаще встречается I тип моторной и сенсорной нейропатии с аутосомно-доминантным характером наследования. При II типе полинейропатии с аутосомно-доминантными и аутосомно-рецессивными формами наследования болезнь

дебютирует в более позднем возрасте. Ill аутосомно-доминантный тип наследственной сенсорной и моторной нейропатии идентифицируют с болезнью Дежерина-Сотта. Выделяют также моторные и сенсорные нейропатии с Х-сцепленным доминантным и рецессивным типом наследования.

Молекулярный анализ показал, что существуют две генетические формы заболевания со сходной клинической картиной полинейропатии I типа — 1А и 1В. Более чем в половине случаев болезнь развивается вследствие гиперпродукции интегрального мембранного белка компактного миелина периферической нервной системы, получившего название Ртр-22 — периферический миелиновый белок22. Гиперпродукция белка происходит вследствие дупликаций области локализации гена РМР22, присутствующих у 70—90% пациентов с типом IA болезни Шарко-Мари-Тус. Таким образом, это заболевание является уникальным случаем наследуемой частичной трисомии, при которой идентифицирован главный и, возможно, единственный ген, связанный с данной патологией. В гораздо более редких случаях у пациентов обнаруживаются гетерозиготные мутации в гене РМР22, также приводящие к клинике моторной и сенсорной нейропатии I типа. Интересно отметить, что гипопродукция периферического миелинового белка22, происходящая вследствие делеции области локализации гена РМР22, является причиной другой формы доминантной нейропатии с возможным развитием парезов вследствие сдавления ствола нерва.

Вторая генетическая форма полинеропатий I типа — IB связана с дефектами главного структурного белка периферического миелина — Р(0). Р(0) составляет более 50% всего белка, присутствующего в оболочках периферических нервов. В центральной нервной системе Р(0) не обнаружен. Это интегральный мембранный белок, связывающий соседние ламеллы посредством гомофильных взаимодействий, что обеспечивает компактизацию и стабилизацию всего миелинового комплекса. Большинство мутаций, идентифицированных у пациентов с формой IB болезни Шарко-Мари-Тус, сопровождаются заменой или потерей одной из аминокислот во внеклеточном домене Р(О), играющем значительную роль в миелиновой мембранной адгезии. В то же время синдром Дежерина-Сотта не является генетически самостоятельной нозологической формой, а представляет собой аллельные варианты болезни Шарко-Мари-Тус двух разных типов 1А и 1В.

Из всех доминатно наследуемых форм болезни Шарко-

Мари-Тус около 20% составляет II тип нейрональной полинейропатии, также представляющий генетически гетерогенную группу заболеваний. II тип болезни Шарко-Мари-Тус включает по крайней мере четыре формы — 2A-2D. Несмотря на клиническое сходство аксональных и нейрональных форм заболевания, между ними, по-видимому, существуют фундаментальные различия, поскольку СМТ2-гены не является аллельными вариантами ни одного из СМТ1-генов, картированных к настоящему времени.

Х-сцепленная доминантная форма болезни ШаркоМари-Тус обусловлена мутациями в гене бета коннексина 32 (Сх32), активно экспрессирующемся в периферической нервной системе. Коннексины участвуют в образовании межкле­

точных каналов за счет совмещения мембранных пор. По этим каналам может осуществляться прямой обмен небольшими молекулами и ионами между соседними клетками и роль таких контактов особенна важна в синаптической передаче. Недавно было показано, что наследственные дефекты других бета коннексинов 26 и 31 лежат в основе развития двух различных форм изолированной нейросенсорной тугоухости. В связи с этим уместно вспомнить, что тугоухость как симптом часто входит в комплекс невральной полинейропатии.

Идентификация других генов, ответственных за наследственные формы полинейропатии, пока не проведена, однако не исключено, что один из аутосомно-рецессивных вариантов болезни Шарко-Мари-Тус связан с дефектом белка 2 периферического миелина.

Последним из заболеваний в этой главе мы рассмотрим боковой амиотрофический склероз, который в 10% случаев носит семейный характер с чертами аутосомно-доминантного наследования с неполной пенетрантностью. В значительном проценте семейных случаев заболевания первичным биохимическим дефектом оказывается Cu/Zn-связывающая супероксиддисмутаза (СОД1). Предложено несколько возможных механизмов для объяснения патогенного действия мутаций в гене SOD1 и избирательной гибели двигательных нейронов при семейном боковом амиотрофическом склерозе. Наиболее вероятным кажется предположение о том, что дестабилизация конформационной структуры мутантной СОД1 сопровождается ее агрегацией и формированием комплексов, преципитирующих в двигательных нейронах. Такая возможность не исключена, если учесть, что Cu/Zn-связывающая супероксиддисмутаза относится к числу мажорных белков, составляющих от 0.5% до 1 % всех цитоплазматических белков нейронов. Более того, в астроци-

тах и клетках Шванна спинного мозга некоторых пациентов, умерших от бокового амиотрофического склероза, обнаруживаются внутриклеточные включения, подобные тельцам Леви, обладающие СОД1 -иммунореакгивностью. Эти находки позволяют предполагать единый патогенетический механизм для таких разных заболеваний, как боковой амиотрофический склероз, болезни мышц, обусловленные накоплением цитоплазматических и/или ядерных включений, нейродегенеративные заболевания, вызванные экспансией полиглютаминового трека, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, прионовые болезни. Данную проблему мы предполагаем обсудить более подробно в заключительной, пятой части монографии.

3.2. Спинальные мышечные атрофии

Наследственно обусловленное поражение мышечной системы вторичного характера, возникающее в результате денервационного процесса, относят к группе мышечных атрофии. Денервация при спинальных амиотрофиях происходит на уровне моторных клеток передних рогов спинного мозга или в сочетании с их аналогами — двигательными ядрами черепных нервов. Отмеченная локализация патологического процесса обус­

ловливает развитие вялых параличей, составляющих основу клинического синдрома. Детские спинальные мышечные атрофии в зависимости от особенностей клинических проявлений и преимущественной локализации параличей делят на проксимальные и дистальные. Более редкая детская дистальная спинальная амиотрофия в настоящей работе не обсуждается в связи с отсутствием сведений о характере молекулярного дефекта.

Достаточно изученной и более многочисленной является группа проксимальных детских спинальных амиотрофий. Выделяют три типа детских спинальных амиотрофий. Все три типа объединяет аутосомно-рецессивный характер наследования, локализация патологического процесса в моторных клетках передних рогов спинного мозга, симметричные периферические параличи конечностей, прогрессирующее течение болезни, ранняя инвалидизация и летальный исход, обусловленный вовлечением в процесс мышечной системы, обеспечивающей дыхание. Дети, страдающие спинальными амиотрофиями, отличаются нормальным интеллектом.

Параклинические методы, используемые для диагностики заболевания и определения уровня поражения периферического отдела нервной системы, дают сходные результаты. Исследование мышечных биотоков (ЭМГ-показатели) четко определяют локализацию процесса в моторных клетках передних рогов спинного мозга. Учитывая системность процесса, любая из исследуемых скелетных мышц обнаруживает специфические изменения. Данные мышечной биопсии указывают на характерную для спинального процесса пучковую мышечную атрофию. Биохимические исследования, направленные на определение активности сывороточных ферментов, участвующих в мышечном метаболизме, определяют вторичный характер поражения скелетных мышц.

а) Проксимальные детские спинальные мышечные атрофии. Тип 1, болезнь Верднига-Гоффмана (MIM: 253300). Тип 2, промежуточный (MIM: 253550). Тип 3, мягкая спинальная амиотрофия КугельбергаВеландер (MIM: 253400)

1. Клиническая характеристика заболевания

Общая частота спинальных мышечных атрофии —1 на 6—10 тысяч новорожденных. Распространенность заболевания: от 2 до 3.3 на 100 000 населения. Частота гетерозиготного носительства:1 на 40—60. Это второе после муковисцидоза наиболее частое сублетальное моногенное заболевание с аутосомно-рецессивным типом наследования. Известны ранние формы, проявляющиеся с рождения, а также состояния, симптомы которых возникают в более поздний период с относительно мягким прогрессированием. Особенности клиники детской спинальной амиотрофии хорошо представлены в отечественной литературе (Савельева—Васильева,1972).

Различают три типа спинальной мышечной атрофии.

Первый тип детской спинальной амиотрофии известен как болезнь Верднига-Гоффмана. В связи с быстрым прогрессированием заболевание получило название «острая форма

детской спинальной амиотрофии». Иногда ее называют «ранняя или врожденная детская спинальная амиотрофия». Первые признаки болезни могут проявить себя уже во внутриутробном периоде недостаточно активным шевелением плода. В этих случаях мышечная слабость и гипотония отмечаются с первых дней жизни. Неврологический статус ребенка укладывается в широкое понятие «вялый ребенок», не ограниченное спинальной амиотрофией. Как правило, с первых дней жизни вялые парезы всей поперечно-полосатой мускулатуры (мышцы шеи, туловища, конечностей) снижают физиологическую мышечную гипертонию конечностей, обусловливают угнетение рефлексов новорожденных. Даже жизненно важные защитный и сосательный рефлексы могут быть снижены или отсутствовать. Своеобразна поза больного. Она напоминает позу лягушки. Верхние конечности отведены в плечевых суставах, слегка согнуты в локтевых и пронированы в лучезапястных. Нижние конечности отведены в тазобедренных суставах, согнуты в коленных и голеностопных. Стопы согнуты, отведены. Грудная клетка обычно деформирована. Она имеет вид «колокола» — верхняя апертура уменьшена в размере, нижняя расширена. Типична деформация грудины. Она может иметь килевидную или воронкообразную форму. Мышечный тонус диффузно снижен, активные движения конечностей ограничены. Ограничение касается как проксимальных, так и дистальных отделов. Нет четкой диссоциации между парезами верхних и нижних конечностей. Парезы всегда симметричны. Пассивно поднятые конечности падают. При пассивном удержании ребенка в вертикальном положении отсутствует опора на нижние конечнос­

ти. Лежа на спине больной ребенок никогда не принимает типичную для раннего возраста позу с поднятыми вверх нижними конечностями. Глубокие рефлексы — коленные и ахилловы, как правило, отсутствуют. Если сохраняются рефлексы на верхних конечностях, то они бывают очень низкими. Мышечные атрофии при достаточно хорошо развитом подкожном жировом слое могут быть не видны. Мышечная слабость распространяется и на дыхательную мускулатуру. Ослабление функции межреберных мышц и диафрагмы в какой-то мере компенсируется активным участием в дыхании мускулатуры живота. Включение в патологический процесс диафрагмы ведет к ослаблению экскурсии грудной клетки. Полный паралич диафрагмы обуславливает парадоксальное дыхание и угрожает жизни ребенка. Характерен тихий голос пациентов. Вовлечение в процесс двигательных ядер черепно-мозговых нервов затрудняет акт сосания. Отчетливее

других можно наблюдать поражение XII пары, в виде атрофии языка и фибриллярных подергиваний. Недостаточная функция мимической мускулатуры находит свое выражение в своеобразном «кукольном» лице ребенка. Психическое развитие не страдает. Течение болезни носит неуклонно прогрессирующий характер. Иногда кратковременная остановка нарастания параличей ошибочно принимается за улучшение.

Темпы моторного развития резко отстают от нормальных критериев. Дети плохо удерживают голову. Не способны самостоятельно поворачиваться в постели, вставать на ноги и стоять. В тех случаях, когда ребенок сидит, будучи посаженным, он опирается на руки, а позвоночник кифозируется. Деформация позвоночника в начале болезни ликвидируется при изменении позы. В дальнейшем же сколиоз, кифоз, кифосколиоз грудного и поясничного отделов становятся фиксированными. Продолжительность жизни больных невелика. Обычно они погибают на первом гс>ДУ жизни. Причиной смерти является дыхательная недостаточность на фоне повторных пневмоний и ателектазов. ИВЛ продлевает жизнь на короткое время. Следует отметить, что хорошие условия жизни, тщательный уход за больным ребенком способны продлить его жизнь на месяцы, но не на годы.

II тип детской спинальной амиотрофии именуется хроническим или промежуточным. Его отличают чуть более позднее начало, относительно медленное прогрессирование, лучшая жизнеспособность и ряд клинических признаков. Внутриутробное развитие плода не вызывает беспокойства. Шевеление, как правило, наступает своевременно и продолжается достаточно активно на протяжении всей беременности. Дети рождаются доношенными. В периоде новорожденное™ и в первое полугодие жизни темпы психомоторного развития соответствуют возрастным критериям. Доречевое развитие оказывается нормальным. Первые признаки болезни в виде мышечной слабости возникают постепенно и не всегда сразу улавливаются родителями. Начало болезни следует отнести к 6—14 месяцам жизни и крайне редко позднее. Можно отметить определенную последовательность в развитии парезов. Сперва страдают проксимальные отделы нижних конечностей, а затем в процесс вовлекаются верхние конечности, мускулатура шеи и туловища. Преимущественное поражение ног остается на протяжении всей жизни пациента. В типичном случае начало заболевания относится ко второму полугодию первого года жизни. Ребенок утрачивает те движения, которые он ранее выполнял без труда. Так, если он самостоятельно садился, вставал на ноги, переступал, то эти функции, требующие хорошей мышечной силы, постепенно утрачиваются, и новые не приобретартся. В начальном периоде болезни атрофии не определяРтся, костные деформации не выражены. Глубокие рефлексы снижаются. Вначале угасает коленный рефлекс. На первый план выступает мышечная слабость и гипотония. В тех случаях, когда ходьба возможна (самостоятельная или с посторонней помощью), походка раскачивающаяся, с опорой на внутренние поверхности стоп. невозможен. В развернутом периоде болезни клиническая симптоматика становится выраженной и достаточно стандартной. Заболевание носит системный характер — страдает симметрично вся поперечно-полосатая мускулатура. Однако преимущественное поражение определенных мышечных групп создает типичные деформации конечностей, грудной клетки, позвоночника. Так, в нижних конечностях отмечаются сгибательные контрактуры в тазобедренных и коленных, разгибательные и отводящие в голеностопных суставах. Нижние конечности принимают вид Х-образных. На верхних конечностях из-за контрактур ограничивается разгибание предплечья и супинация кисти. Слабость мышц спины ведет к деформации позвоночника в виде кифосколиоза, иногда с ротаторным компонентом. Грудная клетка принимает форму воронкообразной, реже — килеобразной («куриной»). Весьма характерным клиническим признаком является тремор верхних конечностей, усиливающийся при активных движениях. Тремор может быть выражен очень слабо, и его не всегда замечают родители. В этом периоде болезни дети не способны ходить, садятся с посторонней помощью, опора на ноги отсутствует. Мышечные атрофии становятся отчетливыми. Они охватывают мускулатуру нижних и верхних конечностей, грудной клетки и живота. Утрачиваются все глубокие рефлексы. Черепно-головная иннервация поражается незначительно. Преимущественно вовлекаются в процесс ядра XII, XI и в меньшей степени VII пары. Мускулатура лица грубо не страдает, можно отметить лишь недостаточную мимическую активность. Поч­

ти всегда можно обнаружить признаки атрофии языка и фибриллярные подергивания. Голос и плач больных не громкий, что можно объяснить не столько слабостью голосовых связок, сколько недостаточной функцией дыхательной мускулатуры. Последняя является причиной частых пневмоний, которые переносит ребенок на протяжении

жизни и приводят к летальному исходу. Интеллект больного никогда не страдает, что отличает детскую спинальную амиотрофию от некоторых других ранних форм нервномышечных заболеваний. На всем протяжении заболевания характерен общий гипергидроз. В процессе заболевания усиливаются парезы, нарастают атрофии, становятся более грубыми костные деформации как результат нарушения трофики. Наряду с мышечными атрофиями уменьшается подкожный жировой слой, становятся заметнее фасцикулярные подергивания мышц. Значительно реже в процессе усиливающихся атрофии увеличивается подкожножировой слой, тогда атрофии преимущественно можно наблюдать только в языке. Течение заболевания неуклонно прогрессирующее. Продолжительность жизни может достигать 15—18 лет. Любая интеркуррентная инфекция утяжеляет течение болезни.

Ill тип детской спинальной амиотрофии известен как болезнь Кугельберга-Веландер. Заболевание рассматривается как мягкая форма. Это относится к клиническим проявлениям, более медленному прогрессированию и большей продолжительности жизни. Начальные проявления мышечной слабости отмечаются на втором году жизни, хотя эти сроки могут быть более поздними. Периферические парезы нижних конечностей обнаруживаются тогда, когда к движениям ребенка предъявляются достаточно высокие

требования. Это — ходьба, бег, прыжки, вставание с пола, подъем по лестнице. Нагрузка оказывается подчас непосильной. Изменяется походка, ребенок раскачивается при ходьбе, опирается на внутренние поверхности стоп. Опора при ходьбе осуществляется на выпрямленные в коленных суставах конечности. Сгибание ног в коленных суставах, очень легкое приседание ведут к падению. Используются вспомогательные движения при вставании, перемене положения из горизонтального в вертикальное. Утрачивается способность прыгать и бегать, если она ранее имелась. В развернутой стадии болезни дети отличаются особенностями телосложения. Широкое межлопаточное пространство дополняется крыловидными лопатками. Как правило, усилен поясничный лордоз, выпячен вперед живот, уплощена в передне-заднем направлении грудная клетка. Эти деформации выражены не столь грубо, как подобное имеет место при предыдущих формах. Парезы конечнос­

тей и мускулатуры шеи и туловища носят симметричный генерализованный характер. Порядок вовлечения мышечных групп стереотипен. Первыми страдают проксимальные отделы нижних конечностей и мышцы таза. Далее слабость охватывает мышцы проксимальных отделов верхних конечностей и плечевого пояса. Постепенно становится заметной слабость остальных мышц конечностей, спины, живо­

та. Ранее других угасают коленные рефлексы, затем двухи трехглавых мышц верхних конечностей. Брюшные и подошвенные рефлексы могут длительное время быть сохранными или незначительно сниженными. Стопы имеют склонность к плосковальгусной деформации. Атрофии мышц носят диффузный характер. Фасцикулярные подергивания наблюдаются в различных мышечных группах, наиболее часто в области надплечий, спины, груди. Гипотония определяется во всех мышечных группах, что способствует избыточным движениям в суставах. Контрактуры в конечностях появляются только в поздних стадиях заболевания, в период, когда самостоятельное передвижение больных становится невозможным. Респираторные инфекции у больных могут наблюдаться на протяжении всей жизни. Черепные нервы грубо не страдают, могут иметь место легкая атрофия языка и фасцикуляции. Продолжительность жизни больных более высокая, чем в предыдущих группах и

достигает 2—3 десятилетий. Подтверждение диагноза любого из трех типов детской спинальной амиотрофий дают показатели электрофизиологического и морфологического исследований мышц. Электромиограмма свидетельствует о патологическом процессе в моторных клетках передних рогов спинного мозга. В мышечных биоптатах обнаруживается так называемая пучковая атрофия.

2. Картирование гена SMA и генетическая характеристика

SMA-обпасти

Локус, ответственный за развитее всех трех форм детской спинальной мышечной атрофии, картируется в районе 5q12.2-q13, и сами эти заболевания представляют собой аллельные варианты мутаций одного или, точнее, группы тесно сцепленных генов (Daniels et al., 1992)- Картированию гена SMA (spinal muscular atrophy) способствовало обнаружение его тесного сцепления с высокоинформативным динуклео-

тидным микросателлитным повтором, локализованным в длинном плече хромосомы 5 (Lein et Э1. 1991). Фланкирующими маркерами SMA, расположенными на расстоянии около 2 сМ друг от друга, являются с дистальной стороны ДНКмаркер D5S6 и с проксимальной — геИ МАР1 В, кодирующий белок, ассоциированный с микротруб<?чками. Область локализации этих генов площадью около 850 кб — SMA область — содержит большую инвертированную дупликацию и характеризуется присутствием многих повторяющихся низкокопийных элементов, множественных копий отдельных генов, необычных экспрессирующихся интрон-сЭДержащих псевдогенов, функциональные копии которых разбросаны по всему геному. Среди низкокопийных элементов в SMA-области особенно обильно представлены повторы, специфичные только для хромосомы 5 и локализованные в областях 5q13-14,5q11 13, 5q31 и 5q35 (Melki et al., 1994; Francis et al., 1995). Bo многих локусах SMA-области идентифицированы гипервариабельные микросателлитные повторы, й по крайней мере два из них AG1-CA и САТТ1 представляют гобой примеры мультилокусного мультиаллельного полиморфизма. В каждой хромосоме 5 эти локусы или сублокусы мсгут быть представлены одной—пятью копиями. Эта изменчивость возникает посредством делеций/дупликаций и определенно указывает на геномную нестабильность SMA-области- Генетическая структура этой области напоминает структуру 600-кб-сегмента HLA класса III хромосомы 6, содержащего гены С4А и С4В комплемента, CYP21 ген стероидной гидроксилазы 21 и псевдоген этого гена CYP21P, псевдоген рибосомального белка — RPL32PH 2 других локуса ХА и ХВ, гомологичных гену тенансцина, функциональная копия которого локализована в 9q33. При этом гены С4 могут быть представлены в 1—3 копиях по типу мультилокусных полиморфных локусов САТТ1 и AG1СА SMA-области. Псевдогены HLA III области экспрессируются, но при трансляции не образуется функциональных про­

дуктов. Мутационные повреждения СУР21-гена, главным образом делеций и конверсии между CYP21 и CYP21Р, являются причиной адрено-генитального синдрома, частота которого (1:12 ООО) сопоставима с частотой спинальной мышечной атрофии. Таким образом, этот район 6р, подобно SMAобласти 5q, содержит множественные копии отдельных генов, экспрессирующиеся интрон-содержащие псевдогены и

локус, гомозиготные делеций или конверсии которого являются причиной развития аутосомно-рецессивного заболевания — адрено-генитального синдрома.

Наличие большого числа повторяющихся элементов в

SMA-области затрудняет клонирование ДНК и большинство космидных, фаговых и YAC-клонов, изолированных из этих районов, содержат множественные внутренние делеций и/ или дупликации. Поиск кандидатного гена для SMA был осложнен также в связи с присутствием в этой области большого числа необычных разбросанных по всему геному псев­

догенов, имеющих высокий процент гомологии с экзонами функциональных генов. Примерами таких необычных псевдогенов являются независимо идентифицированные в разных лабораториях в SMA-области и в 5р13-р14 — областях последовательности, имеющие 90% идентичности с экзонами гена бета-глюкуронидазы, функциональная копия которого локализована в хромосоме 7. Обнаружены две «вариантные» формы гена РМСН, кодирующего промеланин-концентрирующий гормон. Функциональный ген РМСН расположен в 12-й хромосоме. В SMA-области также локализован экспрессирующийся псевдоген нейронального кадхерина — нового члена семейства кадхериновых генов, функциональная копия которого картирована в 5р13-р14 (Thompson et al., 1995). Большинство псевдогенов имеют как экзонные, так и интронные области, а также содержат множественные стоп кодоны, препятствующие образованию функциональных белковых продуктов. Однако сами последовательности псевдогенов включаются в процессированные мРНК, транскрибируемые с SMA-области. Поэтому при идентификации кодирующих последовательностей в SMA-области с использованием современных методов позиционного клонирования необходимо исследовать, действительно ли отобранный экзон является частью функционального гена, который может бать кандидатным для SMA, или это фрагмент нефункционального псевдогена. Доказательство функциональности экспрессирующихся последовательностей требует использования достаточно трудоемких методов.

3. Идентификация и молекулярная характеристика гена

SMN

Несмотря на эти сложности, из SMA-области методом улавливания экзонов было изолировано достаточно много кодирующих последовательностей (Thompson et al., 1995; van der Steege et al., 1995a). Эти экзоны были использованы для скрининга различных тканеспецифических библиотек генов. Результатом данной работы явилась изоляция 20 кДНК-клонов, 17 из которых были дуплицированы в SMA или в других областях генома либо содержали высокоповторяющиеся последовательности. Одна из трех оставшихся уникальных кДНК — XS2G3 — не имела гомологии ни с одним из известных генов. Более того, область геномной ДНК, гибридизующейся с этим кДНК-зондом, оказалась полностью делетирована более чем у 50% пациентов со спинальной мышечной атрофией типа I. При проведении подобного анализа у 245 здоровых людей, включая 143 облигатных гетерозигот,

 

гомозиготная делеция была обнаружена только у двух родителей пациентов со спинальной мышечной атрофией. На основании этих результатов было высказано предположение, что XS2G3 является частью гена, кандидатного для SMA. Ме­

тодом нозерн блот-гибридизации было показано, что этот ген экспрессируется во множестве тканей. Большое количество 6.5-кб транскрипта обнаруживается в скелетных мышцах, два типа мРНК размером примерно 1.9 и 1.2 кб найдены в поджелудочной железе.

Одновременно с этими исследованиями в двух разных лабораториях методами позиционного клонирования из SMAобласти были изолированы два различных экспрессирующихся функциональных гена, полностью делетированные у большинства больных со спинальной мышечной атрофией. Наиболее значимым из них оказался ген, расположенный в локусе D5S125 и названный авторами геном выживания двигательных нейронов — SMN (survival motor neurons) (Lefebvre et al. 1995). Размер гена составляет 20 ООО пар оснований, его кодирующая часть разделена на 8 экзонов, причем восьмой экзон не транслируется. SMN — высококонсервативный ген. Его ортологи найдены у нематоды Caenorhabditis elegans и у дрожжей Schizosaccharomyces pombe.

Ген SMN оказался дуплицирован в области 5q12.2-q13. Его копия, располагающаяся несколько ближе к центромере, — SMNC или SMN2 — также транскрибируется, хотя и отличается от теломерной копии гена — SMN* или SMN1— наличием пяти точечных мутаций. При этом в кодирующей области гена обнаружены только две замены — одна из них в экзоне 7, а другая в экзоне 8. Эти две мутации позволяют отличить оба гена путем амплификации экзонов 7 и 8 и их исследования методом SSCP анализа. Ген первоначально был назван CBCD541 по аналогии с первым вариантом названия теломерной копии — tBCD541. Ген SMN2 экспрессируется, но, в отличие от гена SMN1, его кДНК подвергается альтернативному сплайсингу с утратой экзона 7. Оказалось, что ген SMN2 может отсутствовать либо, наоборот, быть представлен несколькими копиями (Lefebvre et al. 1995). У разных индивидуумов число копий SMN2 на диплоидный геном варьирует в пределах от 0 до 5. В общей популяции ген SMN2 отсутствует у 6.7% индивидуумов, представлен одной копией у 13.3%, двумя копиями — у 73.3% и у 6.7%индивидуумов число копий на диплоидный геном больше двух (Velasco et al., 1996). С использованием метода твердофазного мини-секвенирования показано присутствие трех различных доминантных гаплотипов по соотношению количества теломерных и центромерных копий SMN-гена в группе нормальных индивидуумов и в семьях больных (Schwartz et al., 1997).

  1. Идентификация мутаций у пациентов со спинальной мышечной атрофией

Около 93% больных со спинальной мышечной атрофией любого типа несут гомозиготные делеции области локализации теломерной копии гена — SMN1. Остальные пациенты содержат подобные делеции в гетерозиготном состоянии, при этом в гомологичной хромосоме у них обнаруживаются либо сплайсинговые мутации, реализующиеся в виде инсерций/ делеций в мРНК гена SMN1, либо миссенс-мутации, локализованные чаще всего в З’-районе гена SMN1. У одного из пациентов с первым типом спинальной мышечной атрофии идентифицирована дукпликация 11 нуклеотидов в 6 экзоне гена SMN1 (Parsons et al., 1996). Полученные данные были убедительно подтверждены в последующих исследованиях (Brahe et al., 1996; Williams et al., 1996) и дали основание для того, чтобы именно данную теломерную копию гена SMN считать ответственной за заболевание.

Показано, что при делеции теломерной копии гена SMN центромерная копия экспрессируется более интенсивно. Примерно у 5% больных центромерная копия SMN2 оказывается вовлеченной в гомозиготную делецию. Эта цифра сопоставима с процентом лиц контрольной группы, не имеющих центромерной копии SMN2. Среди всех обследованных больных со спинальной мышечной атрофией не обнаружены случаи одновременной делеций обоих гомологичных SMNгенов. Возможно, такая аберрация проявляется как доминантная леталь еще в эмбриогенезе. Наличие гомозиготных делеций или повреждающих мутаций в SMNI-гене, является необходимым, но недостаточным условием для развития болезни, так как в небольшом проценте случаев обнаруживаются гомозиготные делеций в гене SMN1 у здоровых родственников больных (Cobben et al., 1995; Wang et al., 1996). Описано несколько полиморфизмов в гене SMN1 (Wang et al., 1996; Velasco et al., 1996). Один из них в экзоне 7 может быть при проведении молекулярной диагностики ошибочно принят за делецию этого экзона. Другая полиморфная нейтральная мутация приводит к образованию гибридного гена SMN, в котором экзон 7 теломерной копии гена сочетается с экзоном 8 SMN2. Такая аберрация, по-видимому, возникает за счет генной конверсии между теломерной и центромерной копиями SMN. Поскольку экзон 8 не транслируется, гибридный ген может быть полностью функционален.

  1. Характер экспрессии гена SMN

Теломерная и центромерная копии гена SMN активно экспрессируются во многих типах тканей с образованием мРНК размером в 1700 п.о. (Liu, Dreyfuss, 1996). Особенно высокие уровни экспрессии наблюдаются в мозге, почках и в печени, умеренные — в скелетных и сердечной мышцах и низкие уровни экспрессии характерны для фибробластов и

лимфоцитов.

С использованием набора антител, сконструированных на разные детерминанты белка, показано, что белок выживания двигательных нейронов присутствует в цитоплазме и в ядрах клеток (Liu, Dreyfuss, 1996). Ядерная форма белка най­

дена в структурах, названных темами (gem от ‘Gemini of the coiles bodies’). Эти новые структуры внутри спиральных тел размером 0.1-1 микромикрон выявляются пока только антителами против белка выживания двигательных нейронов. Повидимому, они ассоциированы с гетерогенными ядерными рибонуклеопротеинами, предположительно участвующими в метаболизме и в процессинге мРНК. Показано, что гемы внутри спиральных тел ко-локализованы со сплайсеосомальными факторами.

С использованием метода иммуноблота показано, что характер экспрессии гена SMN заметно меняется в постнатальном периоде по сравнению с эмбриональным (Burlet et al., 1998). Во всех тканях плода, за исключением скелетных мышц, белок выживания двигательных нейронов имеет диффузное распределение в цитоплазме. При иммуногистохимическом анализе мышц обнаруживается пятнистое окрашивание, что позволяет предполагать ассоциацию SMN-белка с большими цитоплазматическими структурами, сходными по величине с темами. Седиментационный анализ показывает, что SMN-белок тесно ассоциирован с тяжелыми комплексами, не связанными с мембранами. Эти результаты указывают на важную роль белка выживания двигательных нейронов в эмбриональном развитии.

Иммуногистохимический анализ показал, что в фибробластах, лимфобластах и в мышцах пациентов не наблюдается резкого снижения количества SMN-белка (особенно при наиболее тяжелом первом типе заболевания), однако число гемов значительно уменьшено, причем это уменьшение по­

ложительно коррелирует с тяжестью течения заболевания (Coovert et al., 1997). Подобный анализ гемов в культивируемых первичных фибробластах больных может быть использован как очень эффективный диагностический тест. Кроме того, в отличие от других тканей, в спинном мозге пациентов с первым типом заболевания наблюдается резкое, почти 100-кратное снижение общего количества продукта гена SMN, что находится в соответствии с клиническим течением этой

формы спинальной мышечной атрофии. Заметно снижено количество этого белка и в скелетных мышцах больных.

Идентификация крысиного гомолога SMN и конструирование антител на продукт этого гена позволили провести исследование характера его экспрессии в ЦНС с использованием иммуногистохимического анализа и метода гибридизации in situ с мРНК (Battaglia et al., 1997). У новорожденных и взрослых животных белок выживания двигательных нейронов локализован главным образом в цитоплазме нейронов и особенно обильно представлен в нижних двигательных нейронах. Присутствие мРНК гена SMN зарегистрировано в пластинке дуги IX грудного позвонка. Подобный характер экспрессии гена SMN не противоречит предположению о том, что отсутствие белка выживания двигательных нейронов, наблюдаемое у подавляющего большинства пациентов со спинальными амиотрофиями, является причиной специфической дегенерации нейронов.

Обнаружены два альтернативных транскрипта гена SMN: полноразмерный и с делецией области, соответствующей экзону 7 (Gavrilov et al., 1998). Делетированная изоформа транскрибируется исключительно с гена SMN2. В норме количество полноразмернй изоформы РНК-транскрипта в

лимфобластозных клеточных линиях вдвое выше по сравнению с делетированной. В культурах клеток пациентов с любой формой спинальной мышечной атрофии полноразмерная изоформа составляет лишь 55—60% по сравнению с нормой. При этом клетки пациентов со спинальной мышечной атрофией типа I и II продуцируют соответственно на 27% и на 2 1 % больше альтернативного транскрипта, в то время как в клетках пациентов с типом III заболевания количество аль­

тернативного транскрипта на 54% меньше по сравнению с контролем. Эти данные подтверждают вклад SMN2-reHa в патогенез спинальной мышечной атрофии.

6. Функции белка выживания двигательных нейронов

Продуктом гена SMN является ранее неизвестный белок, состоящий из 294 аминокислот, с молекулярным весом 38 кД. Этот белок содержит домен модулярной олигомеризации, кодируемый экзоном 6 (Lorson et al., 1998). Подавляющее большинство идентифицированных миссенс-мутаций в гене SMN1 приводят к аминокислотным заменам именно в этом домене или в непосредственной близости от него. При этом наблюдается прямая корреляция между степенью нарушения процесса олигомеризации и тяжестью течения спинальной мышечной атрофии. Продукт центромерной копии SMN2, кодируемый экзонами 1—6, но не 7, имеет уменьшенную способность к самоассоциации. По-видимому, нарушение способности к олигомеризации является первичным биохимическим дефектом при спинальной мышечной атрофии и течение заболевания определяется содержанием в клетках компетентных по олигомеризации форм белка выживания двигательных нейронов.

В карбокси-терминальном районе SMN-белка идентифицирован высококонсервативный тирозин-глициновый триплет (YxxG)3, сходный по структуре с RGG-боксами РНК-связывающих белков (Talbot et al., 1997). Примечательно, что пять миссенс-мутации расположены именно в этой (Уххв)-триплицированной области, что является дополнительным указанием на ее функциональную значимость (Lefebvre et al., 1995; Talbot et al., 1997; Hahnen et al., 1997). Эти данные также рассматриваются как косвенные подтверждения возможного участия белка выживания двигательных нейронов в метаболизме мРНК. Однако они не объясняют, почему мутации в гене SMN ведут к такому специфическому нейромышечному поражению.

Биохимический анализ подтвердил критическую роль продукта гена SMN в процессинге РНК и его участие в биогенезе рибонуклеопротеинового комплекса сплайсеосом (Lefebvreet al., 1998). Район белка выживания двигательных нейронов, кодируемый экзоном 2, непосредственно участвует в связывании РНК, а также обладает связывающей ак­

тивностью по отношению к однонитевой и двунитевой ДНК (Lorson, Androphy, 1998). Этот домен гомологичен факторам связывания нуклеиновых кислот, включая некоторые белки, содержащие высокомобильные группы (НМб).Обнаружение в этом домене миссенс мутации, резко уменьшающей РНКсвязывающую активность SMN-белка, у одного из пациентов со спинальной мышечной атрофией доказывает функциональную значимость его взаимодействия с нуклеиновыми кислотами. С другой стороны, в ряде экспериментов выявлена антиапоптозная роль белка выживания двигательных нейронов.

В геноме человека в области 10q23 идентифицирован еще один ген, кодирующий ядерный белок, родственный про­

дукту гена SMN (Talbot et al., 1998). Этот ген экспрессируется во многих тканях и особенно активно в скелетных мышцах. Показано, что новый белок, кодируемый SMN-родственным геном и обозначаемый как SPF30, также входит в комплекс сплайсеосом. Его гиперэкспрессия в культуре HeLa клеток индуцирует апоптоз. Исследование SPF30 имеет важное значение для понимания функционирования SMN-родственных белков и их участия в патогенезе спинальной мышечной атрофии.

  1. Молекулярная диагностика спинальной мышечной атрофии

В настоящее время возможна прямая молекулярная диагностика спинальной мышечной атрофии более чем у 98% пациентов. Она основана на амплификации и анализе экзона 7 гена SMN1, отсутствующего у подавляющего большинства больных. Экзоны 7 генов SMN1 и SMN2 дифференцируют методом SSCP-анализа. Однако следует учитывать, что примерно в 4% образцов ДНК, полученных от бессимптомных членов семей со спинальной мышечной атрофией, присутствует полиморфная мутация в экзоне 7, которая может быть интерпретирована в условиях SSCP-анализа как делеция экзона 7 (Wang et al., 1996). Дискриминация этих двух ситуаций приобретает особую важность при проведении пренатальной диагностики. В данном случае анализ должен быть дополнен исследованием делеций экзона 8. В последнее время разработан еще более удобный метод диагностики спинальной мышечной атрофии, основанный на рестрикционном анализе определенных ПЦР-продуктов экзонов 7 и 8 (van der Steege et al., 1995b).

  1. Вклад в патогенез спинальных мышечных атрофии другиу генов, расположенных в SMA-области

В непосредственной близости от теломерного конца гена SMN1 идентифицировано еще три гена, расположенных в 500-кб инвертированной дупликации, перекрывающей SMAобласть. Один из них NAIP — ген ингибитора нейронального апоптоза также представлен в SMA-области несколькими высокогомологичными копиями, хотя, по-видимому, только одна из них содержит полный набор экзонов (Roy et al., 1995). Этот ген имеет высокий процент гомологии с бакуловирусными генами, вовлеченными в ингибирование апоптоза в инфицированных клетках насекомых. Оказалось, что кодирующая последовательность XS2G3, идентифицированная в процессе поиска гена SMA (Thompson et al., 1995), комплементарна экзону 7 и фланкирующим интронным областям NAIP-гена (Mahadevan et al., 1995). От 40% до 70% больных с тяжелой клинической формой спинальной мышечной атрофии первого типа и от 14% до 22% пациентов со II и III типами имеют в гомозиготном состоянии делецию специфических экзонов NAIP-гена (Roy et al., 1995; Velasco et al., 1996). Однако и у бессимптомных облигатных гетерозигот подобная делеция обнаруживается в 2% случаев. Таким образом, утрата NAIP сама по себе недостаточна для развития болезни. Имеются ли точковые мутации в NAIP-гене у пациентов со спинальной мышечной атрофией, в настоящее время неизвестно. Подавляющее большинство пациентов (96%) с гомозиготными делециями экзона 5 NAIP-гена также несут делеции гена SMN1. Однако описаны редкие пациенты, у которых при наличии гомозиготной делеции в гене NAIP сохранены экзоны 7 и 8 гена SMN1.

Ближе всех к SMN1 оказался расположен другой ген H4F5, делетированный у 90% больных со спинальной амиотрофией I типа (Scharf et al., 1998). H4F5 активно экспрессируется с образованием двух альтернативных транскриптов во многих тканях, включая спинной мозг и центральную нервную систему. Продукт этого гена, по-видимому, участвует в связывании нуклеиновых кислот и, подобно продукту гена SMN, ко-локализован с малыми ядерными ринуклеопротеиновыми комплексами (мяРНП), участвующими в процессе сплайсинга. H4F5-reH также рассматривается как возможный модификатор тяжести течения спинальной мышечной атрофии.

Третий ген, расположенный по соседству от SMN1 и также представленный несколькими копиями, — BTF2p44 — кодирует р44 субъединицу базального транскрипционного фактора II (van der Steege et al., 1995a; Carter et al., 1997). Этот белок, являющийся субьединицей комплекса РНК полимеразы II, участвует в транскрипции и репарации, сопряженной с транскрипцией. Оказалось, что одна из копий этого гена

делетирована по крайней мере у 15% пациентов со спинальной мышечной атрофией. Однако никакой корреляции меж­

ду тяжестью течения заболевания и делецией гена BTF2p44 не обнаружено.

Для изучения связи между характером мутационных повреждений и типом заболевания был проведен молекулярный анализ делеций в генах SMN1 и NAIP у пациентов из 187 семей, при этом в 77 семьях наблюдали больных с типом I спинальной мышечной атрофии, в 69 — с типом II и в 41 —с типом III (Rodriguesetal., 1996). Делеций в каждом из изученных генов могут встречаться как при тяжелых, так и при очень мягких типах спинальной мышечной атрофии. 93.5% пациентов оказались гомозиготны по делециям хотя бы части теломерной копии SMN1, причем в подавляющем большинстве случаев были делетированы оба экзона: 7 и 8. Изолированные делеций экзона 8 не были найдены ни у одного больного. У облигатных гетерозиготных носителей по­

добных делеций в теломерной копии SMN1 не найдено. У всех оставшихся пациентов, кроме двух, присутствовали обе копии гена SMN и по крайней мере одна копия гена NAIP. У одного больного была обнаружена гомозиготная делеция по экзону 5 NAIP-гена и у другого — гомозиготная делеция по экзонам 7 и 8 центромерной копии SMN2. Следует подчеркнуть, что гомозиготные делеции в NAIP-гене обнаруживаются у 1.9% фенотипически нормальных носителей, причем, как правило, эти гетерозиготы оказываются родителями пациентов с I типом заболевания. Кроме того, гомозиготные делеции центромерной копии SMN2 были найдены у 19 из 358 обследованных контрольных индивидуумов и не обнаружены ни у одного из 373 облигатных гетерозигот. Гомозиготные делеции в SMA-области большей протяженности связаны с более тяжелыми формами заболевания. Так, случаи одновременных делеций в генах SMN и NAIP значительно чаще встречаются среди пациентов с первым типом заболевания, в то время как пациенты со II и III типами не различаются по характеру делеций.

Показано, что около 50% больных со спинальной мышечной атрофией I типа на каждой из гомологичных хромосом 5 несут только одну копию мультилокусных микросателлитных маркеров С212 и AG1-CA (Wirth et al., 1995). 10% таких пациентов несут гемизиготную делецию в области лока­

лизации этих маркеров. AG1-CA расположен в 5′-конце гена SMN1, а С212 — проксимальнее SMN1 в последнем интроне гена H4F5. Для AG1 -СА, так же как и для САТТ1, обнаружена сильная аллельная ассоциация с самыми тяжелыми формами заболевания. У пациентов со II и III типами количество копий этих маркеров достоверно больше, чем с первым типом заболевания. Если учесть, что ген SMN1 у подавляющего большинства пациентов со спинальной мышечной атрофией делетирован, увеличение числа копий данных маркеров может быть связано с эффектом дозы центромерной копии SMN2. Действительно, у родителей пациентов с I типом заболевания, как правило, сохранены 2 копии SMN2, в то время как у 66.5% и 75% родителей больных с типами II и III обнаруживается от трех до пяти копий этого гена соответственно (Velasco et al., 1996).

Согласно современным представлениям, для развития спинальной мышечной атрофии необходима утрата или мутационное повреждение хотя бы в одном из трех генов SMN1, NAIP и H4F5. Болезнь возникает при гомозиготном состоянии мутаций (обычно делеций) в гене SMN1, при этом различия между формами спинальной мышечной атрофии определяются тремя основными факторами: наличием или отсутствием гомозиготных делеций в генах NAIP и H4F5 (или иных мутаций, существование которых в настоящее время не может быть исключено) и числом центромерных копий гена SMN2 (две — в случае типа I и от трех до пяти — в случае болезни II и III типа). Сходная ситуация генетического контроля определенной функции зарегистрирована для генов, вовлеченных в систему апоптоза у Drosophila melanogaster. Наблюдается функциональный избыток генов апоптоза, так что потеря одного из них может компенсироваться другим геном. В результате для получения мутантной линии мух, дефектных по системе апоптоза, необходимо возникновение мутаций одновременно в двух генах reaper и hid, лежащих в одном и том же районе геномной ДНК (Grether et al., 1995). б) Спинально-бульбарная мышечная атрофия, болезнь Кеннеди (MIM: 313200)

Сцепленная с полом рецессивная спинально-бульбарная мышечная атрофия характеризуется поздним дебютом (после 40 лет), медленным прогрессированием, участием в процессе бульбарной группы черепных нервов, нисходящим распространением параличей. Клиническая картина болезни имеет четкие границы и порядок вовлечения в процесс различных мышечных групп, что облегчает ее клиническую

диагностику. Периферические парезы начинаются с проксимальных отделов верхних конечностей и мускулатуры надплечий. Слабость сопровождается атрофиями пораженных мышечных групп и выраженными фасцикуляциями. Ранее других снижаются сухожильные рефлексы двухи трехглавых мышц. Типичен тремор пальцев рук. В дальнейшем слабость появляется в проксимальных отделах нижних конечностей, снижаются коленные и ахилловы рефлексы. Типично вовлечение в процесс двигательных ядер черепных нервов. Страдает мимическая мускулатура и мышцы, иннервируемые бульбарной группой черепных нервов, обусловливающие дизартрию и дисфагию. Описаны эндокринные нарушения в виде гинекомастии, обусловленной дефектом функционирования гипоталамуса. Впервые спинально-бульбарная мышечная атрофия была описана у 9 мужчин в двух неродственных семьях и с тех пор получила название болезни Кеннеди

(Kennedy et al., 1968).

При семейном генетическом анализе найдено сцепление гена SBMA (spinal and bulbar muscular atrophy) с маркером DXYS1, локализованным в области Xq21.3-q22

(Fischbecket al.,1986). С использованием большого числа микросателлитных полиморфных маркеров удалось точнее локализовать ген SBMA в области Xq12 (Ferlini et al., 1991). Природа молекулярного дефекта, лежащего в основе развития болезни Кеннеди, была расшифрована при обнаружении у пациентов необычно длинного CAG-повтора в гене андрогенового рецептора-AR, локализованного в той же цитогене-

тической области (La Spada, Fischbeck, 1991; La Spada et al., 1991). CAG-повтор, кодирующий цепочку из глютаминовых остатков, расположен в первом экзоне гена AR. В норме наблюдается полиморфизм по длине CAG-повторов со средним числом, равным 22+-3. У пациентов с болезнью Кеннеди было обнаружено 11 аллелей с числом повторов, варьирующим в диапозоне от 40 до 52. Во всех исследованных семьях аномалии по длине данного повтора ко-сегрегировали с заболеванием.

Ген AR клонирован, и определена полная нуклеотидная последовательность его кДНК (Chang et al.,1988; Lubahn et al.,1988). Ген AR кодирует адренорецептор с молекулярной массой 110-112 кД, имеющий три главных функциональных

домена. N-терминальный домен, кодируемый первым экзоном, осуществляет модуляторные функции. ДНК-связывающий домен кодируется экзонами 2 и 3. Андроген-связывающий домен кодируется пятью последующими экзонами. Различные мутации в гене адренорецептора, прежде всего миссенс и нонсенс типа, а также делеций приводят к синдрому тестикулярной феминизации, характеризующемуся генетически детерминированными нарушениями половой дифференцировки, при которых у индивидуумов с кариотипом 46, XY наружные половые органы сформированы по женскому типу.

CAG-повтор, кодирующий полиглютаминовый трек в первом домене адренорецептора, не оказывает никакого влияния на функции связывания ДНК и/или андрогена. Никакой корреляции между величиной CAG-повтора и связыванием андрогена in vitro не наблюдается. В то же время выявлена четкая зависимость между длиной этого повтора и тяжестью течения болезни Кеннеди. При позднем дебюте и мягких клинических проявлениях симптомов заболевания число повторов у пациентов, как правило, не превышает 40. Около 30% экспансированных CAG-аллелей оказываются нестабильны при наследственной передаче. Наблюдается как сокращение числа триплетов, так и их увеличение, при этом нестабильность более выражена в мужском мейозе (La Spada et al., 1992).

В первом интроне гена AR идентифицирован второй полиморфный тринуклеотидный повтор — (GGC)n. Проведено сопоставление уровня полиморфизма по (CAG)n и (GGC)n повторам у 113 пациентов со спинально-бульбарной мышечной атрофией и у 173 контрольных индивидуумов в Японии (Tanaka et al., 1996). Среднее число С AG-повторов в нормальных Х-хромосомах составило 21+-3, в мутантных — 47+-3. В контрольных Х-хромосомах найдено 7 различных аллелей по GGC-повтору с рангом изменчивости от 11 до 17 триплетов.

Наиболее часто (79%) встречался аллель (GGC)16, тогда как частота аллеля (GGC)17 составила лишь1%. В мутантных хромосомах было найдено только 2 аллеля с 16 и 17 GGCповторами с частотами 61%и39%, соответственно. На рис. 22 и 23 представлены результаты этих исследований. Обнаруженное неравновесие по сцеплению между двумя типами тринуклеотидных повторов в гене AR указывает на значительный вклад эффекта основателя в формирование пула мутантных по гену AR хромосом в японской популяции.

 

Рис. 22. Распределение величины CAG-повтора в контрольной популяции (светлые столбики) и у пациентов с болезнью Кеннеди (темные столбики).

Рис. 23. Распределение величины CGC-повтора в контрольной популяции (светлые столбики) и у пациентов с болезнью Кеннеди (темные столбики).

Проведена прямая оценка частоты возникновения мутаций в области локализации CAG-повтора в нормальных аллелях гена AR путем типирования с помощью ПЦР состояния повтора в отдельных зародышевых клетках (Zhang et al., 1994). Всего было протипировано около 4300 сперматозоидов, полученных от 110 доноров. Предварительно частота мутаций этой области была оценена, как 6.7×103. Скорость мутаций для аллелей (CAG) 22-24 сопоставима с той, которая наблюдается при семейном анализе. Частота экспансии аллелей с 28—31 повторами оказалась в 4.4 раза ниже частоты их сокращения, что согласуется с результатами аналогичных экспериментов с геном миотонической дистрофии — DM, но находится в значительном противоречии с наблюдаемой частотой экспансии при отцовской передаче аллелей с 29—44 повторами (6 из 11 — 54%). То есть реальное увеличение числа повторов при прохождении через мужской гаметогенез оказалось в 175 раз больше скорости экспансии, непосредственно наблюдаемой в мужских зародышевых клетках (54% по сравнению с 0.31%). Для объяснения этого парадокса авторы привлекают идею различных мутационных механизмов, ведущих к увеличению числа экспансированных повторов и к их сокращению.

В опытах in vitro показано, что андрогеновый рецептор, так же как и другие белки, содержащие полиглютаминовые треки, способен специфически взаимодействовать с ключевым ферментом клеточного гликолиза — глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназой (Koshy et al., 1996). Агрегация и протеолитический процессинг мутантных форм андрогенового рецептора зависят от длины глютаминового повтора, причем степень нарушения этих процессов коррелирует с уровнем цитотоксичности (Merryet al.,1998). Мутантные формы белка с удлиненными полиглютаминовыми треками обладают повышенной устойчивостью к протеолизу (Abdullahetal.,1998). Даже после обработки таких белков 2М мочевиной глютамин-содержащие фрагменты сохраняют устойчивость к протеолизу. Более того, в культуре COS клеток, трансфецированных фрагментами кДНК гена AR с экспансированными CAG-повторами, образуются аберрантные ассоциированные с ядрами 75-кД белковые производные с удлиненными полиглютаминовыми треками. Такие клетки почти вдвое менее жизнеспособны по сравнению с COS-клетками, трансфецированными нормальной кДНК гена AR, причем их гибель носит характер апоптоза. Подобные нейроно-токсические производные могут образовываться de novo либо вследствие токсического накопления белков, теряющих способность к правильной диспозиции в клетке при наличии в них удлиненных глютаминовых повторов.

Введение кДНКовых конструкций гена AR с экспансированным CAG-повтором (CAG)52 в клетки нейробластомы мыши (NB2a/d1) также сопровождается образованием наряду с полноразмерным адренорецептором с м. в. 114-116 кД его С-терминально-укороченной формы с м. в. 74 кД (Butler et al.,1998). По-видимому, в этом укороченном фрагменте белка сохранен ДНК-связывающий домен, но отсутствует гормон-связывающий. В этом случае не исключено, что токсичность 74 кД изоформы адренорецеп-

тора в двигательных нейронах связана с возможностью инициации транскрипции в этих клетках специфических генов в отсутствие гормонального стимула.

С использованием иммунофлюоресцентной микроскопии показано, что после гормональной активации адренорецептор дикого типа транслоцируется в ядра, тогда как мутантный белок главным образом остается в цитоплазме в форме плотных агрегатов, и лишь небольшая его часть обнаруживается в ядрах. Этим может быть объяснено наблюдаемое уменьшение транскрипционной активности в NB2a/d1 клетках, трансфецированных мутантными конструкциями, по сравнению с клетками, трансфецированными кДНК гена AR дикого типа.

Сконструирована серия трансгенных мышей, несущих ген AR человека с экспансированными CAG-повторами. При использовании для трансгеноза кДНКовых конструкций с 45 и 66 CAG-триплетами никаких фенотипических аномалий у мышей не наблюдается и введенные последовательности оказываются стабильными (Bingham et al.,1995). В отличие от этого, при использовании для трансгеноза геномных конструкций экспансированного AR-гена в составе искусственных дрожжевых хромосом (YAC) введенные последовательности даже с 45 CAGповторами обладают значительной мейотической нестабильностью со средней скоростью экспансии около 10% за поколение, причем эта нестабильность более выражена при материнской передаче (в отличие оттого, что наблюдается у человека) и увеличивается с возрастом самки (LaSpadaet al., 1998). Существенное понижение порога для длины CAG-повтора, при которой возникает подобная нестабильность, указывает на важную роль в этом процессе геномных последовательностей, фланкирующих ген AR. Идентификация цис-действующих элементов,

допускающих подобную нестабильность, и транс-активирующих факторов, способных ее модулировать, могут пролить свет на понимание молекулярных основ контроля общей нестабильности тринуклеотидных повторов у человека.

3.3. Наследственные полинейропатии

Наследственные полинейропатии включают в себя различные формы болезни Шарко-Мари-Тус и синдрома Дежерина-Сотта. Это большая генетически гетерогенная группа заболеваний со сходной клинической картиной. Патологический процесс затрагивает главным образом нижний двигательный неврон. Страдает либо тело мотонейрона, либо, что бывает чаще, его аксональная часть. Сходство клинических проявлений заключается в симметричности парезов, дистальной их локализации, преимущественным вовлечением в процесс перонеальной группы мышц. Моторные нарушения часто сочетаются с сенсорными расстройствами. Парезы сопровождаются мышечными атрофиями, которые в первую очередь затрагивают стопы, голени, затем кисти. Соответственно первыми снижаются, а затем утрачиваются ахилловы и коленные рефлексы. Дистальные парезы следует рассмат-

15 Заказ № 170

ривать как дебют заболевания, в дальнейшем в процесс могут вовлекаться мышцы проксимальных отделов и даже туловища. Течение наследственных полинейропатий медленно прогрессирующее. Степень прогрессирования и тяжесть заболевания в значительной мере зависит от типа нейропатии. Перонеальная мышечная атрофия или болезнь Шарко-

Мари-Тус— наиболее распространенная наследственная периферическая нейропатия у человека. Известны аутосомно-

доминантные, рецессивные и сцепленные с полом формы заболевания. Общая частота всех типов невральных амиотрофии Шарко-Мари-Тус составляет 1 на 2500. В границах синдрома выделяют две наиболее значимые формы.

Чаще встречается I тип моторной и сенсорной нейропатии с аутосомно-доминантным характером наследования. Соответствующие гены получили название HMSN I (hereditary motor and sensory neuropathy I) или CMT1 (Charcot-Marie-Iooth 1). Дебют заболевания относится к первому десятилетию жизни. Начальными симптомами является слабость дистальных отделов нижних конечностей или их деформация в виде эквиноварусных стоп из-за укорочения икроножных мышц. В дальнейшем появляется слабость дистальных отделов верхних конечностей. У большинства больных выявляется эссенциальный тремор пальцев рук. Одновременно снижаются глубокие рефлексы. Снижение поверхностной чувствительности возникает не постоянно и чаще в более поздней стадии болезни. Атрофиям подвергаются главным образом мышцы стоп, голеней, кистей. Заболевание медленно прогрессирует. Для заболевания типично снижение скорости проведения по нерву. С генетической точки зрения эта клинически однородная группа состоит по крайней мере из 3 заболеваний, каждое из которых связано с дефектами разных генов — СМТ1А, СМТ1ВиСМТ1С.

II тип моторной и сенсорной нейропатии (СМТ2) с аутосомно-доминантным и аутосомно-рецессивным типами наследования характеризуется более поздним дебютом по сравнению с I типом полинейропатий. Обычно процесс начинается с дистальных отделов конечностей в виде слабости и утомляемости главным образом передней группы мышц голеней. Снижение или угасание рефлексов выражены в меньшей степени, чем при I типе полинейропатии, как и уровень чувствительных нарушений. Скорость проведения по нерву нормальная. При морфологическом исследовании обнаруживается

дегенерация аксонов.

Для аутосомно-рецессивной формы моторно-сенсорной нейропатии II типа типично раннее начало и более тяжелое и прогрессирующее течение. Начальные признаки болезни проявляются в первом десятилетии жизни, чаще в возрасте 3—5 лет. Парезы, имеющие все признаки периферических, захватывают дистальные отделы сперва нижних, а затем и верхних конечностей. Атрофии мелких мышц голеней и стоп, а также предплечий и кистей сопровождаются контрактурами, приводящими к деформациям. Стопы принимают поло­

жение эквиноварусных, кисти согнуты в средних и концевых фалангах. Отмеченные дефекты моторики рано затрудняют самообслуживание ребенка. Двигательные нарушения сочетаются с сенсорными. Страдает главным образом поверхностная чувствительность по полиневритическому типу.

Ill тип аутосомно-доминантной наследственной сенсорной и моторной нейропатии идентифицируют с болезнью Дежерина-Сотта. Для последней характерно появление с 6—7 лет слабости дистальных отделов конечностей, постепенно прогрессирующей и переходящей затем на проксимальные отделы. В таком же направлении угасают глубокие рефлексы. Появляются атрофии мышц, вторичные костные деформации. Типично уплотнение нервных стволов (утолщается локтевой, седалищный нервы). Могут отмечаться боли в конечностях. Однако при молекулярно-генетическом анализе заболевания было показано, что синдром Дежерина-Сотта не является самостоятельной нозологической формой, а представляет собой аллельные варианты болезни Шарко-Мари-Тус двух разных типов 1Аи 1В.

Выделяют также моторные и сенсорные нейропатии с

Х-сцепленным частично доминантным и Х-сцепленным ре-

 

цессивным типом наследования. В первом случае стенотипические проявления более выражены у лиц мужского пола и отсутствует передача мутантного гена от отца к сыну. Клиническая картина соответствует наследственной моторносенсорной нейропатии I типа (HMSN1). У гетерозиготных девочек клинические проявления заболевания могут быть незначительны. Данные биопсии нервных волокон показывают первичную атрофию с вторичной демиелинизацией. Клиническая картина Х-сцепленной рецессивной полинейропатий нередко сочетается с умственной отсталостью и неблагоприятным витальным прогнозом.

На этом генетическая гетерогенность наследственных полинейропатий не ограничивается. В настоящее время идентифицировано 3 и картировано не менее 13 генов, ответственных за различные варианты этих заболеваний (табл. 12).

Таблица 12 Локализация генов, ответственных за различные варианты наследственных полинейропатий

Ген

Локализация

MIM

СМТ1А, РМР22

17р11.2

118220, 145900

СМТ1В, MPZ, МРР

1q23-q25

118200, 145900

СМТХ1,СХ32

Xq13-q21

302800

СМТХ2

Хр22.2

302801

СМТХЗ

Xq26

302802

СМТ2А

1р36-р35

118210

СМТ2В

3q13-q22

600882

СМТ2С

?

158580

OMT2D

7р14

601472

СМТ4А

8q13-q21.1

214400

СМТ4В

11q23

601382

CMTND

5q23-33

601596

HSN1

9q22.1-q22.3

а) Болезнь Шарко-Мари-Тус тип IB (MIM: 118200; 159440; 145900)

Ключевым моментом для картирования, а в дальнейшем и идентификации гена, дефектного при невральной амиотрофий Шарко-Мари-Тус 1В типа, явилось обнаружение в ряде семей косегрегации заболевания с определенными аллелями генов, локализованных в центромерном районе длинного плеча хромосомы 1 (Bird et al., 1980; Guiloff et al., 1982). В этих же семьях было обнаружено сцепление заболевания с генами антитромбина III —АТЗ, альфа-субъединицы слюнной амилазы — AMY1, аполипопротеина А2 — АРОА2 и Fcфрагмента иммуноглобулинового кластера генов IgG — FCGR2A, расположенных в районах 1q23-q25,1р21 ив 1q21q23 (два последних гена соответственно) (Griffits et al., 1987; 1988; Lebo et al., 1989). Описание редких пациентов с болезнью Шарко-Мари-Тус 1В типа, несущих небольшие хромосомные перестройки в области 1q23-q25 — микроделеции и транслокации, — способствовало сужению области поиска дефектного гена с 18сМ до 6 сМ, что соответствовало сокращению физического интервала с 15% хромосомы 1 до 3% (Lebo et al., 1991). Был использован целый комплекс цитогенетических и молекулярных методов для более точного кар­

тирования гена СМТ1В (Qharcot-Marie-Iooth 1 В), включая сортинг хромосом, флюоресцентную гибридизацию in situ, спот-блот анализ, изоляцию с помощью пульсирующего гельэлектрофореза и клонирование крупных фрагментов геномной ДНК из области поиска гена.

Наиболее вероятным кандидатом на роль гена, дефектного при типе IB болезни Шарко-Мари-Тус, оказался находящийся в тесном сцеплении с FCGR2A и АРОА2 ген периферического миелинового белка МРР (myelin protein peripheral), известный также как ген миелинового гликопротеина Р(0) — MPZ (myelin protein zero) (Oakey et al., 1992). Ген MPZ высококонсервативен и специфическим образом экспрессируется в миелин-формирующих клетках Шванна. Он состоит из 6 экзонов, распределенных на площади около 7 кб геномной ДНК (Lemke, Axel 1985; Hayasaka et al., 1993a). Первые 28 аминокислот, кодируемых MPZ, не представлены в зрелом белке и образуют сигнальный пептид, направляющий продвижение Р(0) к эндоплазаматическому ретикулуму. Р(0) — главный структурный белок периферического миелина с молекулярным весом 28 кД, составляет более 50% всего белка, присутствующего в оболочках периферических нервов. Этот интегральный мембранный белок связывает соседние ламеллы посредством гомофильных взаимодействий, что обеспечивает компактизацию и стабилизацию всего миелинового комплекса. Тремя другими главными компонентами этого комплекса являются основной и протеолипидный белки мие­

лина, а также гликопротеин, ассоциированный с миелином. В центральной нервной системе Р(0) не обнаружен.

Картирование гена MPZ в области 1q22-q23 явилось основанием для его анализа в качестве кандидатного гена при болезни Шарко-Мари-Тус 1В. При молекулярном обследовании пациентов из разных семей с невральной амиотрофией Шарко-Мари-Тус 1В типа, были обнаружены многочисленные мутации в гене MPZ (Hayasaka et al., 1993b; Kulkens et al., 1993; Su et al., 1993). Большая часть этих мутаций относится к миссенс-типу, описаны также небольшие делеции и мутации, нарушающие процесс сплайсинга. Дефекты локализованы главным образом в высококонсервативном районе гена, полностью идентичном у крыс, коров и человека. Следствием этих мутаций является замена или потеря одной из аминокислот во внеклеточном домене Р(О), играющем значительную роль в миелиновой мембранной адгезии. Одна из миссенс-мутации — К96Е, по-видимому, является мажорной. У гетерозигот по К96Е наблюдается типичная клиника полинейропатий. Две мутации в MPZ-гене были обнаружены

у пациентов с синдромом Дежерина-Сотта. Одна из них сопровождалась аминокислотной заменой во внеклеточном, а

другая — в трансмембранном домене Р(О). Эти находки подтвердили генетическую идентичность некоторых форм синдрома Дежерин-Сотта и болезни Шарко-Мари-Тус IB типа.

6) Болезнь Шарко-Мари-Тус тип IA (MIM: 118220; 145900); нейропатия наследственная со склонностью к развитию парезов вследствие сдавления ствола нерва (MIM: 162500)

  1. Картирование гена СМТ1А

Более чем в половине семей с типичным течением болезни Шарко-Мари-Тус I типа не обнаруживается сцепления с генетическими маркерами хромосомы 1, и в частности с геном Fy, определяющем группу крови Даффи. Это позволило выдвинуть предположение о существовании двух генетических форм заболевания 1А и 1В со сходной клинической картиной, а следовательно, и о наличии другого, отличного от MPZ гена, ответственного за развитие невральной амиотрофий Шарко-МариТустипа 1А — СМТ1А. Действительно, оказалось, что в тех семьях, где не обнаруживается сцепления с геном Fy, наблюдается косегрегация заболевания с определенными аллелями двух маркерных локусов перицентрического района короткого плеча хромосомы 17 — D17S58 и D17S71 (Middleton-Price et al., 1990; Nicholson et al., 1989). При более детальном генетическом анализе сцепления, выполненном в одной большой бельгийской семье, в которой на протяжении многих поколений наблюдали больных с моторно-сенсорной нейропатией, было показано, что ген СМТ1А локализован в области 17р12-р11.2 между маркером D17S71 и геном MYH2, кодирующим полипептид-2 тяжелой цепи миозина скелетных мышц (Timmerman et al., 1990). В дальнейшем были идентифицированы многочисленные фланкирующие ДНК-маркеры и составлена карта области локализации СМТ1А-гена настолько подробная, что расстояние между двумя соседними маркерами не превышает 0.5 сМ (Patel et al 1990; Lebo et al., 1992).

  1. Молекулярно-генетическая характеристика

СМТ1Аобласти

Значительный прогресс в понимании молекулярно-генетических основ невральной амиотрофий Шарко-Мари-Тус 1А типа связан с обнаружением у многих неродственных пациентов гетерозиготных дупликаций различной протяженности, расположенных в коротком плече хромосомы 17 в области локализации дефектного гена — в так называемой СМТ1А-области (Lupski et al., 1991). При моногенном заболевании подобное нарушение, сопровождающееся сегментной трисомией, описано впервые. Наличие таких дупликаций в геноме человека, по-видимому, является одним из возможных механизмов доминантного типа наследования. Частота дупликаций в области 17р11.2 у пациентов с болезнью Шарко-Мари-Тус I типа достигает 68%, причем в некоторых случаях удается проследить возникновение по­

добной перестройки de novo (Wise et al., 1993). Ни у одного из исследованных пациентов с типом II невральной амиотрофии Шарко-Мари-Тус дупликаций в 17 хромосоме не было найдено. Молекулярный анализ дупликаций этой области позволяет проводить дифференциальную диагностику пациентов с периферическими нейропатиями. Наиболее информативным методом молекулярной диагностики дупликаций является идентификация с помощью гель-электрофореза в пульсирующем поле необычных рестрикционных фрагментов (junction), образующихся на границах вовлеченных в перестройку участков ДНК. У разных пациентов дупликации могут включать различные ДНК-маркеры, фланкирующие ген СМТ1 А, и наиболее частым из них оказывается D17S122. Дупликации представляют собой прямые тандемные повторы, что было показано с использованием различных молекулярных методов анализа

(Valentijn et al., 1992а; Pentao et al., 1992). Минимальная оценка размера дупликаций составляет 1100 кб. В то же время описаны пациенты, у которых размер дуплицированного фрагмента настолько велик, что перестройка видна при цитогенетическом анализе. В видимые дупликации оказываются вовлеченными все ДНК-маркеры, дуплицированные у пациентов с более короткими перестройками, плюс дополнительные маркеры, фланкирующие с двух сторон СМТ1А-область. В гораздо более редких случаях СМТ1Аобласть оказывается не дуплицированной, а делегированной (Chance et al., 1993).

Сопоставления между расстояниями на генетической и физической картах показывают, что район 17р11.2 является горячей точкой рекомбинации, и это может быть причиной его генетической нестабильности. Эта гипотеза в дальнейшем нашла экспериментальное подтверждение. Так, в области 17р12-р11.2 было идентифицировано несколько низкокопийных повторов, один из которых — СМТ1A-REP — является достаточно протяженным и составляет 17 килобаз (Pentao et al., 1992; Chance et al., 1994). У одного из пациентов данный повтор фланкировал дуплицированную область размером 1.5 Мб на нормальной хромосоме и был представлен дополнительной копией на хромосоме с дупликацией. Подобное расположение CMTIA-REP-повторов согласуется с предположением о том, что возникновение дупликаций de novo может происходить в мейозе за счет неравного кроссинговера, обусловленного ошибочным выстраиванием этих последовательностей при спаривании гомологичных хромосом. Делеций СМТ1 А-области, по-видимому, являются реципрокными продуктами неравного кроссинговера. В прямых экспериментах по изучению родительского происхождения дупликаций было показано, что во всех 9 проанализированных спорадических случаях дупликации возникли в сперматогенезе и явились следствием неравного обмена между несестринскими хроматидами (Palau etal., 1993). Показано, что в редких случаях материнского происхождения делеций 17р11.2 области являются следствием внутрихромосомных перестроек (LeGuern et al., 1996).

  1. Нейропатия наследственная со склонностью к развитию парезов вследствие сдавления ствола нерва

У пациентов, несущих делеций в СМТ1 А-области, наблюдается склонность к периодическим парезам с утратой чувствительности вследствие сдавления ствола нерва, усиливающихся при травматических повреждениях. В большинстве случаев пациенты с данной формой нейропатии восстанавливаются за несколько дней или недель, но часто могут наблюдаться рецидивы с тенденцией к сохранению парезов в течение более длительного периода. При исследовании биоптатов периферических нервов наблюдаются фокальные утоньшения миелиновой оболочки в участках нервного волокна между соседними перехватами Ранвье. Оказалось, что подобная доминантная форма нейропатии со склонностью к развитию парезов вследствие сдавления ствола нерва (HNPP — MIM 162500) чаще всего связана с делециями области 17р11.2 (Cance et al., 1993; LeGuern et al., 1994). Размер делеций, как правило, составляет 1.5 Мб и они включают те же самые ДНК-маркеры, которые оказываются вовлеченными в дупликации при болезни Шарко-Мари-Тус 1А типа.

  1. Идентификация гена РМР22

Параллельно с анализом молекулярной природы мутаций, лежащих в основе развития невральной амиотрофии Шарко-Мари-Тус IA типа, проводились интенсивные поиски модели этого заболевания среди существующих генетических линий мышей. Было высказано предположение, что аутосомно-доминантно наследуемая гипомиелиновая нейропатия у мышей в мутантной линии Trembler (Тг) может служить подобной моделью (Vance, 1991). Основаниями для этого предположения явились два факта — сходство между фенотипом мутантных мышей и клиническими симптомами заболевания, а также локализация мышиного гена Тг на 11 хромосоме, синтенной 17-й хромосоме человека, где предположительно картировался ген СМТ1 А. В двух независимо полученных генетических линиях Trembler удалось идентифицировать 2 различные точковые мутации в одном и том же гене Gas-З, кодирующем потенциально рост-регулирующий миелиновый белок с молекулярным весом 22 кД (Suter et al., 1992). Семейство мышиных генов Gas, кодирующих белки негативного контроля роста клеток (арест-специфические белки роста), было клонировано методом субтрактивной гибридизации на основе различной экспрессии в покоящихся и делящихся клетках (Schneider et al., 1988). 6 из этих генов картировано и один из них — Gas-З оказался локализован в 11-ой хромосоме на 44 сМ проксимальнее мышиного гена р53. Gas-З кодирует мембранный белок, получивший название Ртр-22 — периферический миелиновый белок-22.

С помощью мышиного гена Gas-З удалось изолировать кДНК и геномные клоны гена РМР22 (peripheral myelin protein22) человека (Patel et al., 1992). Было показано, что ген РМР22 локализован в области 17р12-р11.2, дуплицированной у пациентов с болезнью Шарко-Мари-Тус 1А типа (Timmerman et al., 1992; Matsunami et al., 1992). Этот ген активно экспрессируется в клетках Шванна и в тканях периферических нервов. Белковый продукт гена РМР22 локализован главным образом в компактном миелине периферической нервной системы, состоит из 160 аминокислот и является интегральным мембранным белком с 4 трансмембранными доменами. Окончательным доказательством идентичности генов СМТ1А и РМР22 явилось обнаружение специфических мутаций в РМР22-гене у тех относительно немногих пациентов с болезнью Шарко-Мари-Тус IA типа, у которых СМТ1 А-область не дуплицирована (Valentijn et al., 1992b; Roa et al., 1993a). Одна из этих миссенс-мутаций в гене РМР22 — L16P оказалась гомологичной той, которая была идентифицирована в гене Gas-З мышиной линии Trembler (Valentijn etal., 1992b). В предварительных исследованиях, проведенных в данной семье, было показано тесное сцепление мутантного гена с ДНК-маркерами, локализованными в районе 17р11.2, что позволило отнести этих больных к типу 1А невральной амиотрофий Шарко-Мари-Тус. Однако у большинства пациентов в этой семье болезнь протекала в крайне тяжелой форме, и на основании клинических, нейрофизиологических и морфологических кри­

териев многим из них мог быть поставлен диагноз синдрома Дежерина-Сотта (Hoogendijk et al., 1993). Кроме того, две другие миссенс-мутаций в РМР22-гене — М69К и S72L идентифицированы в семьях с клиническим диагнозом болезни Дежерина-Сотта, что еще раз свидетельствует о том, что этот синдром не является самостоятельной нозологической формой (Roa et al., 1993b). Одна из пациенток с тяжелой формой болезни Шарко-Мари-Тус I типа оказалась компаунд гетерозиготой по рецессивной миссенс-мутации в РМР22-гене и 1.5Мб делеции, локализованной в 17р12-р11.2 (Roa et al., 1993b).

Ее сын, гетерозиготный по миссенс-мутации в РМР22 гене, был здоров. В то время как двое родственников этой женщины, гетерозиготные носители 1.5-Мб делеции, были больны наследственной нейропатией со склонностью к парезам вследствие сдавления ствола нерва.

  1. Мутации в гене РМР22

Преобладающим типом мутационных повреждений в гене РМР22 у пациентов с невральной амиотрофией ШаркоМари-Тус 1А типа являются дупликации. По данным разных авторов, они были обнаружены в 68% (Wise et al.,1993), 92% (lonasescu etal., 1993), 82% (Mostacciuoloetal., 1995) и в 9 1 % семей с СМТ1 (lonasescu et al., 1995), а также в 9 из 10 спорадических случаев заболевания (Hoogendijk et al., 1992). Таким образом, СМТ1А является уникальным случаем наследственной частичной трисомии, при которой идентифицирован главный и, возможно, единственный ген, связанный с

данной патологией. Другим локусом, гиперэкспрессия которого приводит к тяжелым неврологическим состояниям, повидимому, является недавно идентифицированный по ана­

логии с геном minibrain (mnb) Drosophila melanogaster ген MNB, кодирующий серинтреонинпротеинкиназу, играющую существенную роль в постэмбриональном нейрогенезе (Guimera et al., 1996). MNB локализован в бенде 21 q22.2, входящем в критический для синдрома Дауна район (DSCR), трисомия по которому и определяет фенотип заболевания. Ген MNB активно экспрессируется в тех структурах мозга, которые поражаются при синдроме Дауна. Все это дает основания предполагать, что гиперэкспрессия MNB может быть определяющим следствием трисомии хромосомы 21 в развитии синдрома Дауна.

  1. Генетические модели болезни Шарко-Мари-Тус IA типа

Мы уже упоминали о том, что спонтанно отобранные генетические линии мышей Trembler с гипомиелиновой нейропатией, наследуемой по аутосомно-доминантному типу, могут рассматриваться в качестве моделей болезни ШаркоМари-Тус 1А типа, так как у мутантных животных присутствуют мутации в гене Gas-З, гомологичном гену РМР22 человека (Vance, 1991). Идентифицированные у мышей мутации затрагивают домены, предположительно ассоциированные с мембраной. Кроме того, методом направленного разрушения гена («нокаут») получена трансгенная линия Ртр22-дефицитных мышей с доминантно наследуемой периферической нейропатией (Adlkofer et al., 1995).

Хотя генетические линии Trembler, так же как и трансгенная линия Ртр22-дефицитных мышей, являются адекватными моделями данной формы полинейропатии, обусловленной точковыми мутациями в гене РМР22, они не могут использоваться для анализа молекулярных последствий гиперэкспрессии этого гена. Для анализа фенотипических последствий мутаций подобного типа была сконструирована трансгенная линия мышей, содержащих около 8 дополнительных экспрессирующихся копий гена РМР22 человека (Huxley et al., 1996). Эта линия была создана путем прямой инъекции в пронуклеус соответствующей генетической конструкции, находящейся в составе дрожжевого вектора (YAC). Дрожжевые искусственные хромосомы являются идеальными векторами для создания подобных модельных линий животных, так как они содержат регуляторные элементы, обеспечивающие высокий уровень тканеспецифической экспрессии. Оказалось, что у мутантных животных этой трансгенной линии развивается доминантно наследуемая нейропатия, сходная с болезнью Шарко-Мари-Тус I типа с прогрессирующей слабостью передних конечностей и значительной демиелинизацией периферической нервной системы с появлением луковицепо-

добных образований. Уровень экспрессии введенного гена РМР22 оказывает прямое влияние на степень демиелинизации, не меняя при этом ее характер. Гистологический и электрофизиологический анализ пяти подобных трансгенных линий мышей, несущих от одной до семи дополнительных копий гена РМР22, показал, что патологический процесс находится в прямой зависимости от уровня экспрессии трансгена (Huxley et al., 1996). Когда отношение между человеческими и мышиными мРНК оказывается меньше 0.8, никаких аномалий не наблюдается. При значениях этого соотношения, лежащих в диапозоне от 0.8 до 1.5, поведенческих признаков нейропатии у мышей не обнаруживается, однако выявляются гистологические аномалиии и нарушения в скорости проведения нервного импульса. При соотношениях, больших 1.5, между уровнями экспрессии периферического миелинового белка-22 человека и мыши у трансгенных животных развивается тяжелая форма нейропатии. Таким образом, линии мышей с гиперэкспрессией гена РМР22 являются наиболее адекватными моделями для болезни Шарко-Мари-Тус 1А типа и перспективны для разработки и испытания различных терапевтических подходов применительно к данному заболеванию, включая отработку методов генной терапии.

в) Х-сцепленная моторная и сенсорная нейропатия (MIM: 302800 -304040;302801; 302802; 310490)

Хорошо доказано существование Х-сцепленных доминантных форм болезни Шарко-Мари-Тус. Так, в одной из семей было прослежено наследование заболевания на протя­

жении 6 поколений (Woratz, 1964). У10 больных отцов в этой семье рождались только больные дочери (15 человек), в то время как все их 8 сыновей были здоровы. У больных матерей, которых в этой семье насчитывалось 26, рождались как здоровые, так и больные дети, причем среди последних было 23 сына и 21 дочь. У мужчин болезнь протекала тяжелее, чем у женщин, то есть наблюдалось частичное доминирование мутантных аллелей. Примеры подобных семей не являются единичными (Phillips et al., 1985; Fischbeck et al., 1986).

При генетическом анализе подобных семей было найдено тесное сцепление мутантного гена СМТХ1 с ДНК-маркерами, локализованным в проксимальной части длинного плеча X хромосомы — Xq13-q21 (Bone et al., 1986; Gal et al., 1985). Ближайшим проксимальным маркером гена СМТХ1 является ген PGK1, кодирующий 3-фосфоглицераткиназу, а дистальным — DXS72 (Goonewardena et al., 1988; Bergofen et al., 1993). Одновременно в той же области Х-хромосомы был картирован ген Сх32, кодирующий один из бета-коннексинов (Corcos et al., 1992). Группа белков, получивших название коннексины, была изолирована из клеточных фракций, обогащенных структурами, образующими канальные контакты между соседними прикрепленными к субстрату клетками (gap

junction). Подобные регионально специализированные структуры на плазменных мембранах контактирующих клеток впервые были охарактеризованы с помощью электронной микроскопии. Коннексины участвуют в образовании межклеточных каналов за счет совмещения мембранных пор (Sosinsky, 1995). По этим каналам может осуществляться прямой обмен небольшими молекулами и ионами между соседними клетками и роль таких контактов особенна важна в синаптической передаче. Коннексины, изолированные из различных

тканей, представляют собой разные белки. Их классификация производится по молекулярному весу и эта цифра вынесена в название белка. Кроме того, на основе структурного сходства все коннексины делят на 2 группы: альфа и бета. Коннексин 32 — это бета-белок с молекулярным весом 32 кД, обильно представленный в клетках печени. Ген Сх32 активно экспрессируется в периферической нервной системе. Цитогенетическая локализациия гена и характер его экспрессии явились основаниями для исследования Сх32 в качестве кандидатного гена, дефектного при Х-сцепленной форме доминантной полинейропатии (Bergofen et al., 1993).

При прямом секвенировании кодирующих областей гена СХ32 у пациентов из различных семей с Х-сцепленной доминантной формой болезни Шарко-Мари-Тус были идентифицированы различные точковые мутации и микроделеции

(Guern et al., 1995; Nelis et al., 1996). Таким образом идентичность генов СМТХ1 и СХ32 была доказана. Недавно было показано, что наследственные дефекты двух других бета-коннексинов 26 и 31 лежат в основе развития двух различных форм изолированной нейросенсорной тугоухости (Zelante et al., 1997; Xia et al., 1998). Напомним, что тугоухость как симптом нередко входит в комплекс полинейропатий.

В ряде семей сцепленные с полом формы невральной амиотрофии Шарко-Мари-Тус наследуются по рецессивному типу. Еще в прошлом веке была описана , в которой на протяжении 4 поколений наблюдали 20 больных мужчин (Heringham, 1889). Три подобные семьи были описаны в 1944 году (Erwin, 1944). При генетическом анализе этих семей, выполненном сравнительно недавно, было показано, что в одной из них мутантный ген СМТХ2 сцеплен с маркерами короткого плеча Х-хромосомы, локализованными в Хр22.2, тогда как в двух других семьях заболевание обусловлено мутациями в другом гене СМТХЗ, тесно сцепленном с маркерами длинного плеча Х-хромосомы — Xq26 (2.11) (lonasescu et al., 1992).

В длинном плече Х-хромосомы картируется ген, связанный с необычной рецессивно наследуемой формой моторно-сенсорной нейропатии Шарко-Мари-Тус II типа, сопровождающейся нейросенсорной тугоухостью и/или умственной отсталостью. Это заболевание получило название синдрома Ковчока (Cowchock). Несмотря на явные клинические отличия, не исключено, что этот синдром связан с реорганизацией областей ДНК, смежных с геном СМТХ1 или двух других СМТгенов, расположенных на Х-хромосоме (Fischbeck et al., 1986).

К числу болезней, обусловленных реорганизацией смежных генов (contiguous gene syndrome), следует, по-видимому, отнести и те случаи, когда рецессивная, сцепленная

 

с полом перонеальная амиотрофия Шарко-Мари-Тус сочетается с наследуемой по тому же типу атаксией Фридрейха, а в некоторых семьях и дополнительно с тугоухостью (Schmickel, 1986).

г) Болезнь Шарко-Мари-Тус, нейронального типа II (MIM: 118210, 600882,158580, 601472)

Несмотря на клиническое сходство аутосомно-доминантных гипертрофических (или аксональных) и нейрональных форм болезни Шарко-Мари-Тус, между ними, по-видимому, существуют фундаментальные различия, поскольку гены СМТ2 не являются аллельными вариантами ни одного из генов СМТ1, картированных к настоящему времени (Hentatiet al., 1992). Из всех доминатно наследуемых форм заболевания СМТ1 составляют около 60% и СМТ2 — около 20%. Болезнь Шарко-Мари-Тус второго типа является генетически гетерогенной группой заболеваний, включающей 4 формы: A-D. Локус СМТ2Абыл картирован при генетическом анализе 6 больших семей с нейрональным типом болезни Шарко-Мари-Тус (Ben Othmane et al., 1993a). Обнаружение сцепления заболевания с микросателлитными маркерами дистального района короткого плеча хромосомы 1 позво­

лило определить наиболее вероятное место локализации гена СМТ2А в районе 1р36-р35 между маркерами D1S244 и

D1S228. Второй локус СМТ2В картирован в длинном плече хромосомы 3 в области 3q13-q22 (Kwon et al., 1995). Клинически отличающаяся форма СМТ2С не связана с локусом короткого плеча хромосомы 1 (СМТ2А), однако ген, ответственный за эту форму болезни Шарко-Мари-Тус второго типа, еще не картирован (Yoshioka et al., 1996).

Новая форма доминантной полинейропатии Шарко-

Мари-Тус второго типа описана в большой семье, насчитывающей 38 членов, 14 из которых являлись больными (lonasescu et al., 1996). Заболевание характеризуется относительно поздним дебютом: от 16 до 30 лет, более выраженной слабостью верхних конечностей по сравнению с нижними, отсутствием или снижением сухожильных рефлексов и медленным прогрессированием. Генетический анализ этой семьи, выполненный с использованием 167 микросателлитных маркеров, позволил картировать локус CMT2D в коротком плече хромосомы 7 в области 7р14. Расстояние между ближайшими фланкирующими маркерами D7S1808 и D7S1806 составляет 6.8 сМ. В этом же цитогенетическом интервале картируется семейство генов Т-клеточных гамма рецепторов, которые являются наиболее вероятными кандидатами для полинейропатий CMT2D. В коротком плече хромосомы 7 картирован ген, ответственный за дистальную форму спинальной мышечной атрофии с преимущественным вовлечением верхних конечностей (Christodoulou et al., 1995). Не исключено, что этот вариант дистальной полинейропатий аллелен CMT2D.

Генетический анализ большой бельгийской семьи с аутосомно-доминантной дистальной моторной полинейропатией II типа и отсутствием электрофизиологических и нейропатологийеских признаков сенсорных аномалий (дистальная HMISTII) позволил картировать ген, ответственный за данную форму заболевания, в длинном плече хромосомы 12 в области 12q24 (Timmerman et al., 1996). Ближайшие фланкирующие маркеры гена HMN II — D12S86 и D12S340 находятся на расстоянии около 13 сМ друг от друга.

д) Нейропатия Шарко-Мари-Тус, тип IV (MIM: 214400; 601382; 601596)

Аутосомно-рецессивные формы болезни Шарко-МариТус встречаются значительно реже, чем доминантные или сцепленные с полом. Считается, что доминантные формы заболевания встречаются в 10 раз, а сцепленные с полом в 2-2.5 раза чаще, чем рецессивные (Skre, 1974). В общем случае при рецессивном наследовании болезнь носит более генерализованный характер, первые клинические симптомы появляются раньше и носят значительно более выраженный характер. Начало заболевания относится к возрасту 2—3 лет.

Симметричные парезы сперва отмечаются в нижних конечностях, затем через 1—2 года появляется слабость верхних конечностей. Типичны парезы дистальных отделов ног и рук. Первыми слабеют разгибатели стоп и пальцев. Меняется ходьба, которая приобретает характер «степпажа». В руках также страдают разгибатели кисти и пальцев рук. Парезы очень рано сопровождаются эквиноварусными деформациями стоп. Кисти и пальцы рук принимают положение сгибания. Атрофии стоп, кистей, голеней и предплечий становятся заметными на ранних сроках болезни. Утрата глубоких рефлексов начинается с дистальных отделов и в течение болезни распространяется в восходящем направлении. Расстройство чувствительности вначале поверхностной, а затем и глубокой происходит по полиневритическому типу. В клиническом и, по-видимому, в генетическом отношении это неоднородная группа заболеваний. В некоторых семьях тяжелая аутосомно-рецессивная невральная амиотрофия сочетается с врож­

денной нейросенсорной тугоухостью (Cornell et al., 1984), в других — с атаксией и денторубральным тремором (Bouchard et al., 1980). Чаще всего при рецессивном типе наследования болезнь протекает в форме тяжелой перонеальной мышечной атрофии, не осложненной какими-либо дополнительными нарушениями — так называемый 4Атип полинейропатии Шарко-Мари Туе. Некоторые клинически однородные рецессивные формы болезни имеют большее распространение в определенных генетических изолятах, особенно если там допустимы родственные браки (Alan, 1939; Beighton et al., 1971).

При генетическом анализе большой тунисской семьи с рецессивной нейропатией 4А типа обнаружено сцепление заболевания с генетическими маркерами длинного плеча хромосомы 8 (Ben Othmane et al., 1993b). Наиболее вероятный район локализации гена СМТ4А— 8q13-q21.1 (табл.12) и ближайший генетический ДНК-маркер — D8S164. В этом же районе локализован ген РМР2, кодирующий белок 2 периферического миелина. По-видимому, РМР2 является наиболее вероятным кандидатным геном для СМТ4А. Генетический анализ, выполненный в другой большой инбредной семье, насчитывающей 10 больных с необычной аутосомно-рецессивной формой болезни Шарко-Мари-Тус, сочетающейся с фокальным скручиванием миелиновых оболочек, позволил картировать мутантный ген — СМТ4В — в области 11q23 в 4-сМ интервале между маркерами D11S1332 и D11S917 (Bolino et al., 1996). Еще один ген — CMTND, связанный с подобной формой заболевания, был картирован в области 5q23-33. Этот результат был получен при проведении генетического анализа с использованием 200 микросателлитных (СА)п-маркеров в большой алжирской семье с похожей формой болезни Шарко-Мари-Тус (LeGuern et al., 1996). Интервал наиболее вероятной локализации соответствующего кандидатного гена также составляет 4 сМ, ближайшими маркерами являются D5S658 и D5S402. Полученные данные являются основой для идентификации методами позиционного клонирования генов, ответственных за аутосомно-рецессивные формы полинейропатией.

е) Наследственная сенсорная нейропатия, тип I (MIM: 162400)

Аутосомно-доминантное заболевание, относящееся к группе наследственных дегенерации с поражением чувстви­

тельных нейронов. Основными симптомами заболевания являются множественные трофические язвы, нередко приводящие к ампутации пальцев. Болезнь развивается вследствие прогрессирующей дегенерации дорзальных корешков ганглиев и двигательных нейронов, сопровождающейся по­

терей чувствительности дистальных сегментов конечностей, особенно болевой и температурной. Позднее развивается мышечная слабость, преимущественно в кистях и стопах с варьирующей по степени нейросенсорной тугоухостью. Типичны хронические язвы, остеомиелит с отторжением костных фрагментов, в том числе метатарзальных костей. Дебют обычно во второй декаде жизни или позднее.

При генетическом анализе 4 австралийских семей, в которых прослежено наследование заболевания на протяжении 2—4 поколений, обнаружено сцепление мутантного гена HSN1 с микросателлитными маркерами длинного плеча хромосомы 9 (Nicholson et al., 1996). В процессе этой работы члены исследуемых родословных, в одной из которых насчитывалось 67 человек, были протипированы по 127 высокополиморфным микросателлитным маркерам, распределенным по всем аутосомам. Определение ближайших фланкирующих маркеров — D9S318 и D9S176 позволило авторам отнести ген HSN1 в область 9q22.1-q22.3. Локус D9S287 обнаруживает максимальное сцепление с геном HSN1. Размер наибо­

лее вероятного интервала локализации гена составляет 4.9 сМ. Два фрагмента ДНК, полностью перекрывающие этот интервал, клонированы в YAC-векторах. Все это является основой для позиционного клонирования и идентификации гена HSN1.

3.4. Боковой амиатрофический склероз

(MIM: 105400)

  1. Клиническая характеристика заболевания

Заболевание отличается своеобразным сочетанием поражения периферического и центрального двигательного невронов. Таким образом, клиническая картина складывается из мышечных атрофии, носящих системный характер при наличии высоких сухожильных и периостальных рефлексов, а также патологических стопных знаков. Боковой амиотрофический склероз начинается в среднем возрасте и носит прогрессирующий характер. В зависимости от течения и клинических проявлений различают: классическую форму с началом парезов верхних конечностей, параплегическую и бульбарную. Патоморфологические исследования нервной системы свидетельствуют об изменениях крупных моторных клеток спинного мозга и их аналогов, расположенных в стволе мозга — ядрах XII, X, VII пар черепных нервов и «склеротических» изменениях пирамидных путей в боковых столбах спинного мозга. Это основные точки приложения патологического процесса, но не единственные. Находят изменения в области задних продольных пучков, в коре различных от­

делов мозга, ядрах головных нервов и др. Клетки коры атрофируются, гибнут и превращаются в «клетки-тени». Это касается клеток 3 и 5-го слоев, страдают и крупные клетки передних рогов спинного мозга. Изменения находят в вегетативных центрах ствола и спинного мозга. Измененными оказываются и оболочки сосудов головного мозга. Мышечные атрофии носят системный характер, их сопровождают фасцикуляции, которые можно выявить и в сохранных мышечных группах. Атрофии начинаются с дистальных отделов конечностей. В дебюте заболевания парезы преобладают над атрофиями. Характерно преобладание слабости в разгибателях по сравнению со сгибателями. В терминальной стадии в процесс вовлекаются все мышечные группы и, что особенно трагично, дыхательная мускулатура. Больные погибают от расстройств дыхания спинального характера. Поражение пирамидной системы находит свое выражение в появлении мышечной гипертонии, ригидности мышц, клонуса стоп, патологических стопных рефлексов. Сухожильные и периостальные рефлексы повышаются. Таким образом, клиническая картина характеризуется парадоксальным сочетанием мышечных атрофии, фасцикуляций и патологически повышенных глубоких рефлексов. Типично повышение нижнечелюстного рефлекса. Весьма характерны мышечные спазмы типа crampi. В зависимости от формы бокового амиотрофического склероза меняется клиническая картина. Особенно отличается бульбарная форма. Процесс в этом случае локализуется в нижней части мозгового ствола. В первую очередь страдают ядерные структуры: нарушается речь от дизартрии до анартрии, появляются атрофии и фибрилляции мышц языка, затрудняется глотание, расстраивается дыхание. В этих случаях имеют место бульбарные дыхательные нарушения, являющиеся причиной гибели больных. Двигательная активность может не нарушаться в течение всей жизни. Длительность болезни от 4 до 12 лет. Течение, как правило, медленно прогрессирующее.

Клинические формы бокового амиотрофического склероза весьма многообразны и наряду с «классическими» проявленими описаны формы с деменцией, с паркинсонизмом и деменцией, ювенильный боковой амиотрофический склероз, сочетающийся или не сочетающийся с деменцией. В10% случаев заболевание носит семейный характер с чертами аутосомно-доминантного наследования. Описаны и аутосомнорецессивные формы заболевания. Для доминантных форм бокового амиотрофического склероза характерна неполная пенетрантность, величина которой зависит от возраста пациентов. Так, у 50% носителей мутантного аллеля болезнь проявляется до 46 лет и у 90% — до 70 лет. Семейные формы клинически не отличаются от спорадических, но в последнем случае болезнь дебютирует в среднем на,-№йат позднее. Различают 3 формы семейного бокового амиотрофического склероза, каждая из которых наследуется по аутосомно-доминантному типу. Первый тип характеризуется быстро прогрессирующей потерей двигательных функций и летальным исходом в течение 5 лет с момента дебюта заболевания. Патоморфологические изменения ограничиваются передними рогами спинного мозга и пирамидными путями. При второй форме семейного бокового амиотрофического склероза находят дополнительные аутопсийные изменения в задних столбах и грудном отделе спинного мозга, а также в кортико-спинальных путях. Третий тип сходен со вторым, за исключением гораздо более длительного течения болезни: до 10, а иногда и до 20 лет.

  1. Метаболизм глутамата при боковом амиотрофическом склерозе

В спинномозговой жидкости больных с боковым амиотрофическим склерозом наблюдаются повышенные концентрации глутамата и аспартата. Глутамат, первичный нейротрансмиттер возбудимости в мозге, может оказывать специфический нейротоксический эффект и может индуцировать дегенерацию нейронов in vivo и in vitro. В мозге транспорт глутамата через плазматические мембраны обеспечивают высокоаффинные глутаматные транспортеры, играющие существенную роль в прекращении действия глутамата как проводника возбудимости, а также в поддержании его внекле­

точной концентрации ниже нейротоксического уровня. При изучении нейрональной ткани пациентов с боковым амиотрофическим склерозом обнаружено достоверное снижение максимальной скорости транспорта высокоафинного глутамата в синаптосомы из спинного мозга, двигательной и сенсорной зон коры головного мозга, исключая зрительную зону, стриатум и гиппокамп (Rothstein et al., 1992). При этом аффинность глутаматного транспортера, а также внутриклеточный транспорт других молекул, таких как фенилаланин или гамма-аминомасляная кислота, у больных с боковым амиотрофическим склерозом не изменены. Подобного дефекта при каких-либо других нейродегенеративных заболеваниях до сих пор не было обнаружено. Поскольку у больных с боковым амиотрофическим склерозом метаболизм глутамата нарушен, была высказана гипотеза о том, что первичным биохимическим дефектом при этом заболевании является высокоаффинный транспортер глутамата.

  1. Картирование и идентификация гена ALS1

Однако генетические исследования опровергли эту гипотезу. При анализе генетического сцепления заболевания с различными ДНК-маркерами, проведенном более чем в 150 семьях с боковым амиотрофическим склерозом, удалось определить наиболее вероятные районы локализации различных дефектных генов. Один из них был картирован в хромосоме 11, другой — в хромосоме 21 (Siddique et al., 1989). В дальнейших исследованиях были представлены убедительные доказательства сцепления гена ALS1 (amyotophic lateral sclerosis 1) с ДНК-маркерами, расположенными в дисталь-

ной части сегмента 21 q22.1 -q22.2 (Siddique et al., 1991). Было обнаружено тесное сцепление ALS1 с геном SOD1, кодирующим Cu/Zn-связывающую супероксиддисмутазу (СОД) и распо­

ложенным в той же области хромосомы 21 (Rosen et al., 1993).

Известны 3 формы супероксиддисмутазы с различной иммунологической специфичностью. Главный растворимый цитоплазматический Си-/гп-содержащий фермент СОД1 кодируется геном, расположенным в длинном плече хромосомы 21. Mn-содержащий фермент СОД2 кодируется геном, картированным в области 6q25. Он преимущественно нахо­

дится в митохондриях и потому отсутствует в эритроцитах. Ген экстраклеточной СОДЗ картирован в области 4р15.2 (Siddique, Deng, 1996). Последние две формы супероксиддисмутазы не связаны с боковым амиотрофическим склерозом.

СОД1 с молекулярной массой в 16 кД имеет гомодимерную структуру. В каждом из мономеров СОД1, состоящем из 153 аминокислот, присутствует активный сайт, содержащий по одному атому меди и цинка. Главной функцией этого фермента является детоксикация нестабильного и высокоактивного супероксида (02.-) до кислорода и перекиси водорода, которая, в свою очередь, расщепляется до воды глюта-

тионпероксидазой или каталазой. Отрицательно заряженный 02.направляется к Си2-содержащему активному сайту по положительно заряженному электростатическому каналу, сформированному 21 высококонсервативными аминокислотными остатками. Помимо диезмутазной активности С0Д1 обладает также пероксидазной активностью и, возможно, металл-связывающей.

Уместно напомнить, что содержание С0Д1 повышено при синдроме Дауна. Это повышение связано с эффектом

дозы гена, возникающим вследствие трисомии по хромосоме 21. Отсутствие в мозге больных глутатионпероксидазной активности, в норме компенсирующей эффект повышенной С0Д1, приводит к увеличению концентрации перекиси водорода в нервных клетках, следствием чего является возникновение угрозы для липидов со стороны свободных радика-

лов. Роль перекисного окисления липидов при старении и при сходных изменениях, происходящих у больных с синдромом Дауна, хорошо известна. Получена трансгенная линия мышей с повышенным содержанием СОД1 (Epstein et al., 1987). Эта линия используется в качестве модели для изучения биохимических эффектов СОД1 при синдроме Дауна.

Учитывая токсический эффект свободных радикалов на нервные ткани и их роль в формировании нейродегенера-

тивных заболеваний, было проведено исследование SOD1 в качестве кандидатного гена для бокового амиотрофического склероза. В первых же исследованиях были выявлены миссенс-мутации в SODI-гене у пациентов с боковым амиотрофическим склерозом, что и явилось доказательством идентичности генов SOD1 и ALS1 (Deng et al., 1993).

  1. Мутаиии в гене SOD1

Миссенс-мутации в экзонах 1, 2, 4 и 5 гена SOD1 найдены у больных не только с семейными, но и со спорадическими случаями бокового амиотрофического склероза (Jones et al., 1993). Одна из этих мутаций — A4V — встречалась неоднократно у многих неродственных пациентов. Идентификация более 20 различных мутаций в гене SOD1 позволила обьяснить около 20% семейных случаев бокового амиотрофического склероза. Впоследствии было выявлено еще несколько десятков новых мутаций в Cu/Zn-супероксиддисмутазном гене у пациентов с семейными формами бокового амиотрофического склероза (Pramatarova et al., 1995). Среди 49 таких мутаций 45 миссенс-типа одна нонсенс-мутация, одна делеция и два мутантных аллеля приводили к нарушению процесса сплайсинга (Siddique, Deng, 1996). В третьем экзоне гена, формирующем активный центр белка и электростатический канал, никаких нарушений не обнаружено. Предполагается, что доминантные мутации в SODI-гене вызывают структурную нестабильность СОД1 за счет формирования мутантных и нормальных гетеродимеров, а также мутантных гомодимеров. Следствием структурной нестабильности является снижение активности фермента до 30—70% по сравнению с нормой. В настоящее время описано более 60 различных доминантных мутаций в гене SOD1 у пациентов с боковым амиотрофическим склерозом.

Характер мутационных повреждений в SODI-гене влияет на клинические особенности проявления бокового амиотрофического склероза, прежде всего на возраст начала и длительность течения заболевания. Так, пенетрантность одной из миссенс-мутаций — D90A, расположенной в 4-м экзоне гена SOD1, составляет не более 38%, что не исключает возможности ее рецессивного наследования (Anderson et al., 1995). Другая миссенс-мутация — I113T обнаружена в нескольких спорадических случаях бокового амиотрофического склероза. Детальный анализ соответствующих семей показал, что это унаследованная, а не вновь возникшая мутация, обладающая крайне низкой пенетрантностью и экспрессивностью. Мутация D90A преимущественно распространена в Швеции и в Финляндии и может встречаться в семьях как с рецессивным, так и с доминантным характером наследования. Так, эта мутация была идентифицирована в 20 исследованных семьях с рецессивным и в 8 с доминантным характером наследования, что доказывает участие эффекта основателя в ее распространении (Al-Chalabi etal., 1998). Для объяснения этого парадокса выдвинуто предположение о существовании другого тесно сцепленного с SOD1 гена, кодирующего некий протективный фактор, способный модифи­

цировать токсический эффект мутантых форм СОД1.

  1. Модельные линии животных

Дальнейший успех в исследовании молекулярных основ патогенеза бокового амиотрофического склероза связан с конструированием трансгенных линий мышей с мутациями в гене супероксиддисмутазы (Dal Canto, Gurney, 1994; Ripps et al 1995; Wong et al., 1995). В четырех таких линиях удалось добиться экспрессии одного из мутантных аллелей, идентифицированных у пациентов с боковым амиотрофическим склерозом, — A4V, G93A, G37R и G86R соответственно. В пятую трансгенную линию был введен нормальный ген SOD1 человека. Гиперэкспрессия любого из введенных мутантных аллелей, в отличие от гиперэкспрессии аллеля дикого типа, приводила спустя 3—4 месяца к развитию у мышей фенотипа, сходного с боковым амиотрофическим склерозом. Интересные данные были получены в опытах по трансгенному разрушению гомологичного Sod1 — гена у мышей (Reaume et al., 1996). Было показано, что отсутствие супероксиддисмутазной активности у

трансгенных животных не препятствует нормальному развитию двигательных нейронов, но значительно увеличивает скорость гибели клеток при повреждении аксонов. Повидимому, функции Cu/Zn-СОД связаны с защитой нейронов и, возможно, других типов клеток в условиях физиологического стресса. У трансгенных мышей со специфической мутацией G85R в гене Sod1 появлению фенотипических аномалий предшествует образование в цитоплазме астроцитов и двигательных нейронов белковых СОД1 -содержащих включений, имеющих плотный центральный кор, а также более мелких СОД1-иммунореактивных белковых агрегатов (Bruijn et al., 1997).

  1. Патогенетические механизмы действия мутаций в гене

SQD1

Предложено несколько возможных механизмов для объяснения действия мутаций в SODI-гене при семейном боковом амиотрофическом склерозе. Согласно первой гипотезе, снижение активности СОД1 ведет к накоплению

токсических супероксидных радикалов. По другой гипотезе, активность СОД1 может быть повышена, в результате чего увеличивается уровень перекиси водорода в клетках, и при его взаимодействии с металлами, такими как Fe, появляются высокотоксичные гидроксильные радикалы. При изучении кристаллической структуры СОД1 обнаружено, что мутации, как правило, расположены не в каталитическом центре, а затрагивают участки консервативного взаимодействия, важные для правильной конформации белка и образования димерных контактов. Это в некоторой степени объясняет доминантный характер наследования бокового амиотрофического склероза. В эритроцитах гетерозиготных носителей мутаций активность СОД составляет около 50% нормы, что находится в соответствии с предположением о нарушении образования димерной структуры зрелого белка.

В опытах in vitro было показано, что мутантные формы СОД1 значительно быстрее, чем нормальные, катализируют уменьшение содержания перекиси водорода, то есть действуют как пероксидазы (Wiedau-Pazos et al., 1996). Возможно, увеличение пероксидазной активности мутантной СОД1 является приобретенной токсической функцией, играющей критическую роль в патогенезе семейных форм бокового амиотрофического склероза, ассоциированных с СОД1. Предложены и другие гипотезы для объяснения механизма избирательной гибели двигательных нейронов при боковом амиотрофическом склерозе.

В прямых экспериментах показано, что каждая из двух миссенс-мутаций в гене SOD1 — G85R и G93A, использованных для успешного моделирования бокового амиотрофического склероза на трансгенных животных, приводит к образованию мутантного белка, способного взаимодействовать с несвойственными для СОД1 метаболитами (Kunst et al., 1997). В частности, мутантные формы СОД1, в отличие от форм дикого типа, взаимодействуют с транслокон-ассоциированным белком дельта (TRAPdelta) и с лизил-тРНК-синтетазой (KARS). Оба эти белка активно экспрессируются в эмбриогенезе в тканях головного и спинного мозга. Взаимодействия между мутантным СОД1 и белками TRAPdelta и KARS могут реализоваться в виде нарушения клеточной локализации или функционирования одного или нескольких из этих трех белков. Подобный пример не является исключением. Аберрантные взаимодействия мутантных белков показаны для некоторых других доминантных нейродегенеративных заболеваний, в частности для хореи Гентингтона и денто-рубральной паллидолюисовой дегенерации. Доминантный характер наследования бокового амиотрофического склероза, по-видимому, определяется тем, что мутации в SOD1 приводят к образованию продукта, обладающего новыми функциями, нарушающими нормальный метаболизм СОД1.

Дестабилизация конформационной структуры мутантной СОД1 может сопровождаться ее агрегацией и формированием комплексов, преципитирующих в двигательных нейронах. Такая возможность не исключена, если учесть, что СОД1 относится к числу мажорных белков, составляющих от 0.5 до 1% всех цитоплазматических белков нейронов. Более того, в астроцитах и в клетках Шванна спинного мозга некоторых пациентов, умерших от бокового амиотрофического склроза, обнаруживаются внутриклеточные включения, подобные тельцам Леви. Эти образования обладают СОД1-иммунореактивностья>. Мы уже отмечали, что подобные образования формируются в астроцитах и в двигательных нейронах трансгенных мышей со специфической мутацией в гене Sod1. Причем по мере прогрессирования двигательных нарушений, сходных с клиникой бокового амиотрофического склероза, количество нерастворимых белковых включений возрастает и одновременно

уменьшается концентрация глиального глютаматного транспортера (GLT-1). Подобно тельцам Леви при болезни Паркинсона и синильным бляшкам при болезни Альцгеймера эти цитоплазматические включения содержат убикитин и синуклеин, пептидный фрагмент которого обладает значительными амилоидогенными свойствами. Накопление нерастворимых убикитин-устойчивых белковых агрегатов в клетках центральной и периферической нервной системы рассматривается в настоящее время как один из общих патогенетических механизмов процесса нейродегенера-

 

ции. Однако это предположение требует дальнейшей экспериментальной проверки.

7. Другие генетические формы бокового амиотрофического склероза

Следует подчеркнуть, что далеко не во всех семьях с боковым амиотрофическим склерозом находят сцепление заболевания с локусами 21 хромосомы. Это неудивительно, если учесть клиническую гетерогенность заболевания. Так, в большой тунисской семье с ювенильной формой бокового амиотрофического склероза и рецессивным характером наследования найдено сцепление гена ALS2 с ДНК-маркерами длинного плеча хромосомы 2, что позволило отнести ген ALS2 в область 2q33-q35 и поместить его между генами COL3A1 и

CRYG, находящимися на расстоянии 20-25 сМ друг от друга

(Hentati et al., 1992; Hentati et al., 1994).

В Пакистане описана рецессивная форма бокового амиотрофического склероза с дебютом в возрасте от 3 до 23 лет. Локус ALS4, ответственный за данную рецессивную форму бокового амиотрофического склероза типа IV, еще не идентифицирован, но исключено его сцепление с маркерами длинного плеча хромосом 2 и 21.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящем издании мы ограничились описанием только моногенных форм и потому не включили сюда такую большую группу нервно-мышечных заболеваний, как миастении. Мы вернемся к описанию этой патологии в пятой части монографии при рассмотрении молекулярно-генетических основ мультифакториальных болезней нервной системы, в этиологии которых наряду с генетическими компонентами значительный вклад вносят средовые факторы. Во второй части монографии будут расмотрены заболевания с преимущественным поражением мозжечка, пирамидной и экстрапирамидной системы. Отдельная глава будет посвящена болезням экспансии. В третьей части мы рассмотрим вопросы молекулярной нейроонкологии. Основное внимание в этой книге будет уделено описанию генетических основ канцерогенеза применительно к опухолям нервной системы. Отдельная глава будет посвящена молекулярно-генетической характеристике болезней нервной системы, связанных с дефектами онкогенов. В заключительном разделе этой книги коснемся вопросов лечения и прежде всего генотерапии опухолей нервной системы. Четвертая часть монографии будет посвящена патологии нервной системы в структуре синдромального поражения: наследственные дефекты обмена аминокислот и углеводов, лизосомные болезни накопления и др. В этой книге мы коротко остановимся на наиболее частых хромосомных болезнях человека с преимущественным вовлечением в патологический процесс нервной системы. В пятой части мы планируем рассмотреть принципиальные подходы к расшифровке молекулярно-генетической природы формирования риска развития некоторых мультифакториальных заболеваний нервной системы, прежде всего таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, рассеянный склероз, инсульт, некоторые формы эпилепсии и миоклонус-эпилепсии, прионовые болезни. В заключительном разделе этой части остановимся на общих метаболических основах патогенеза тех болезней нервной системы, молекулярная природа которых стала известна после идентификации соответствующих генов.

Список литературы

Бадалян Л. О. Детская неврология. М.: Медицина, 1984. 571с.

Бадалян Л. О., Темин П. А., Заваденко Н. Н. и др. Прогрессирующие мышечные дистрофии у детей и подростков: проблемы патогенеза, диагностики, лечения и профилактики (обзор). М., ВНИИМИ серия: охрана материнства и детства), 1988. 64 с.

Баранов А. Н., Киселев А. В., Иващенко Т. Э. и др. Особенности трансфекции и экспрессии кДНК гена дистрофина человека, доставленного в мышцы мышей mdx с помощью синтетических микросфер MF-2 // Генетика. 1998. Т. 34.С.1—6.

Баранов В. С, Тарасенко О. В., Баранов А. Н. и др. Экспрессия гена дистрофина человека в мышечных волокнах мышей mdx после трансфекции с помощью липосом и синтетических олигипептидов // Генетика. 1998. Т. 34. № 7. С. 876—882.

Вельтищев Ю. Е., Темин П. А., Белозеров Ю. М. и др. Наследственные болезни нервной системы. М.: Медицина. 1998.496 с.

Гехт Б. М., Ильина Н. А. Нервно-мышечные болезни. М.: Медицина, 1982. 352 с.

Горбунова В. Н. Молекулярные основы медицинской генетики. СПб.: Интермедика. 1999.211 с.

Горбунова В. Н., Баранов В. С. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. СПб.: Специальная литература, 1997.287 с.

Гринио Л. П. Клинические формы, вопросы патогенеза и медикогенетического консультирования дюшенновской миодистрофии. Дис. докт. мед. наук. М.: 1976.

Гринио Л. П., Агафонов Б. В. Миопатии. М.: Медицина, 1997.216 с. Давиденков С. Н. Наследственные болезни нервной системы. Гос. изд-во Украины. 1925.

Давиденков С. Н. Проблема полиморфизма наследственных болезней нервной системы. Л.: Изд-во ВИЭМ. 1934.138 с.

Давиденков С. Н. Клинические лекции по нервным болезням. Медгиз. 1952. 254 с.

Дрознина Т. А. Клинико-генетические исследования псевдо-гиПертрофической формы прогрессирующей мышечной дистрофии.

Дис. канд. мед. наук. Л. 1970.

Евграфов О. В., Макаров В. Б. ДНК-диагностика наследственных заболеваний // Итоги науки и техники. Генетика человека. 1991 Т. 9. С. 53—126.

Зеленин А. В., Тарасенко О. В., Колесников В. А. и др. Экспрессия гена дистрофина человека в скелетных мышцах мышей mdx после баллистической трансфекции// Генетика. Т. 34. № 6. С. 730—736.

Зинченко А. П., Лобзин В. С, Бузиновский И. С. Наследственные формы миотоний и миотонические синдромы. Киев. Здоровье, 1979.152 с.

Иллариошкин С. Н., Иванова-Смоленская И. А. Молекулярные основы прогрессирующих мышечных дистрофий //Журн. неврол. и психиатр. 1998. Т. 98. С. 55—62.

Красильников В. В. Медико-генетическое консультирование семей с больными мышечной дистрофией Дюшенна. Дис. канд. мед. наук. М. 1989.

Лобзин В. С, Сайкова Л. А., Шиман А. Г. Нервно-мышечные болезни. СПб.: Гиппократ, 1998. 224 с.

Малышева О. В., Иващенко Т. Э., Васильева Т. Н. и др. Изучение аллельного полиморфизма и анализ гаплотипов гена мышечной протеинкиназы у жителей Северо-Западного региона России и у больных миотонической дистрофией // Генетика. 1998. Т. 34. № 2. С. 295—299.

Михайлов В. M., Зеленин А. В., Штейн Г. И. и др. Дифференцировка мышечных волокон мышей mdx после баллистической трансфекции кДНК гена дистрофина человека// Цитология. 1998. Т.40. С. 394—400.

Савельева-Васильева Е. А. Детская спинальная амиотрофия Верднига-Гоффмана (клинико-генетическое исследование). Дис. докт. мед. наук. Л. 1972.

Шишкин С. С. Наследственные нервно-мышечные болезни. M. 1997. 132 с.

Abbs S., Roberts R. G., Mathew С. G., Bentley D. R., Bobrow M. Accurate assessment of introgenic recombination frequency within the Duchenne muscular dystrophy gene// Genomics. 1990. Vol.7. P. 602—606.

Abbs S., Yau S. C, Clark S., Mathew C. G., Bobrow M. A convinient multiplex PCR system for the detection of dystrophin gene deletions:

 

a comparative analysis with cDNA hybridisa-tion shows mistyping by both methods// J. Med. Genet. 1991. Vol. 28. P. 304—311.

Acsadi G., Dickson G., Love D. R. et al. Human dystrophin expression in mdx mice after intramuscular injection of DNA construction// Nature, 1991. Vol. 352. P. 815—818.

Acsadi G., Massie В., Jani A. Adenovirus-mediated gene transfer into striated muscles//J.Mol.Med. 1995. Vol. 73. P. 165—180.

Adballa J. A., Casley W. L, Hudson A. J. et al. Linkage analysis of candidate loci in autosomal dominant myotonia congenita// Neurology. 1992. Vol. 42. P. 1561—1564.

Adlkofer K., Martini R., Aguzzi A. et al. Hypermyelination and demyelinating perepheral neuropathy in Pmp22-deficient micce// Nature Genet. 1995. Vol. 11. P. 274—280.

Ahn A. H., Kunkel L. M. The structural and functional diversity of dystrophin// Nature Genet, 1993. Vol. 3. P. 283—291.

Ahn A. H., Kunkel L. M. Syntrophin binds to an alternatively spliced exon dystrophin//J. Cell Biol. 1995. Vol. 128. P. 363—371.

Alan W. Relation of hereditary pattern to clinical severity as illustrated by peroneal atrophy//Arch. Intern. Med. 1939. Vol. 63. P. 1123— 1131.

Al-Chalabi A., Andersen P. M., Chioza B. et al. Recessive amyotrophic lateral sclerosis families with the D90A SOD1 mutation share a common founder: evidence for a linked protective factor// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 2045—2050.

Allamand V, Sunada Y., Salih M. A. M. et al. Mild congenetal muscular dystrophy in two patients with an internally deleted laminin alpha2chain// Hum. Mol. Genet.1997. Vol. 6. P. 747—752.

Anderson P. M., Nilsson P., Ala-Hurula V. et al. Amyotrophic lateral sclerosis associated with with homozygosity for an Asp90Ala mutation in Cu/Zn-superoxide dismutase// Nature Genet. 1995. Vol. 10. P. 61—66.

Apel E. D., Roberds S. L., Campbell K. P., Merlie J. P. Rapsyn may function as a link between the acetylcholine receptor and the arginbinding dystrophin-glycoprotein complex// Neuron, 1995. Vol. 15. P. 115—126.

Arahata K., Hoffman E. P., Kunkel L. M. et al. Dystrophin diagnosis: comparison of dystrophin abnormalities by immunofluorescence and immunoblot analysis// Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. Vol. 86. P. 7154—7158.

Arikawa E., Hoffman E. P., Kaido M. et al The frequency of patients with dystrophin abnormalities in a limb-girdle patient population// Neurology, 1991. Vol. 41. P. 1491—1496.

Arts W. F., Bethlem J., Volkers W. S. Futher investigations on benign myopathy with autosomal dominant inheritance// J. Neurol. 1978. Vol.217. P. 201—206.

Ashizawa T, Dubel J. R., Harati Y. Somatic instability of CTG repeat in myotonic dystrophy// Neurology. 1993. Vol. 43. P. 2674—2678.

Badorf C, Lee G. H., Lamphear B. J. et al. Enteroviral protease 2A cleaves dystrophin: evidence of cytoskeletal disruption in an acquired cardiomyopathy// Nature Med. 1999. Vol. 5. P. 320—323.

Bakker E., Good N., Wrogemann K. et al. Prenatal diagnosis and carrier detection of Duchenne muscular dystrophy with closely linked RFLPs// Lancet. 1985. March 23. P. 655—658.

Bakker E., Veenema H., Dunnen J.T. et al. Germinal mosaicism increase the recurrence risk for ‘new’ Duchenne muscular dystrophy mutations//J. Med. Genet. 1989. Vol. 26. P. 553—559.

Banker B. Q. In Engel A. G., Franzini-Amstrong C. (eds), The congenital muscular dystrophy// McGraw-Hill Book Company. 1994. N. Y. P. 1275—1289.

BarS., Bamea E., Levy Z.et al. A novel product of the Duchenne muscular dystrophy gene which greatly differs from the known isoforms in its structure and tissue distribution// Biochem. J. 1990. Vol. 272. P. 557—560.

Baranov V. S., Gorbunova V. N., Malisheva О. V. et al. Dystrophin gene analysis and prenatal diagnosis of Duchenne muscular dystrophy in the Russia// Prenat. Diagn. 1993. Vol. 13. P. 323—333.

Baranov V., Zelenin A., Tarasenko O. et al. Human dystrophin gene expression in mdx muscles after in vivo ballistic transfection, application of synthetic oligopeptide complexes and cationic liposomes// NATO ASI Series. 1998. Vol. H 105 Gene Therapy. P. 219—223.

Barton-Davis E.R., Gordier L., Shoturma D.I. et al. J. Clin. Invest. 1999.

Vol. 104. P. 375—381.

Bashir R., Britton S.f Strachan T. et al. A gene related to Caenorhabditis elegans spermatogenesis factor fer-1 is mutated in limb-girdle muscular dystrophy// Nature Genet. 1998. Vol. 20. P. 37—42.

Bashir R.f Strachan Т., Keers S. et al. A gene for autosomal recessive limb girdle muscular dystrophy maps to chromosome 2p// Hum. Molec. Genet. 1994. Vol. 3. P. 455—457.

Battaglia G., Princivalle A., Forti F., Lizier C, Zeviani M. Expression of the SMN gene, the spinal muscular atrophy determining gene, in the mammalian central nervous system// Hum. Mol. Genet. 1997. Vol.6. P. 1961—1971.

Becker R.E. Myotonia congenita and syndromes associated with myotonia. In, (ed.): Topick in Human Genetics. 1977. Vol. III. Stuttgart: Georg Thieme.

Beckmann J. S., Richard I., Hillaire D. et al. Localisation of a gene for limb-girdle muscular dystrophy to chromosome 15// (Abstract). Cytogenet. Cell Genet. 1991. Vol. 58. P. only.

Beggs A. H., Koenig M., Boyce F. M., Kunkel L. M. PCR primers for the dystrophin gene that complement existing ones to detect over 98% of DMD/BMD deletion// Nucleic Acids Res. 1989. Vol. 9. P. 1

Beggs A. H., Koenig M., Boyce F. M., Kunkel L. M. Detection of 98% of DMD/BMD gene deletions by polymerase chain reaction// Hum. Genet. 1990. Vol. 86. P. 45—48.

Beggs A. H., Neimann P. E., Arahata K. et al. Possibvle influences on the expression of X chromosome-linked dystrophin abnormalities by heterozygosity for autosomal recessive Fukujama congenital muscular dystrophy// Proc. Natl. Acad. Sci. 1992. Vol. 89. P. 623—627.

Beighton P. H. Recessively inherited Charcot-Marie-Tooth syndrome in identical twins// Birth Defects Orig. Art. Ser. 1971. Vol. Vll(2). P. 105

only.

Ben Hamida M., Fardeau M., Attia N. Severe childhood muscular dystrophy affecting both sexes and frequent in Tunisia// Muscle Nerve. 1983. Vol. 6. P. 469—480.

Ben Othmane K., Ben Hamida M., Pericak-Vance et al. Linkage of

Tunisian autosomal recessive Duchenne-like muscular dystrophy to the pericentromeric region of chromosome 13q// Nature Genet.1992. Vol.2. P. 315—317.

Ben Othmane К., Midddleton L.T., Loprest LJ. et al. Localization of a gene (CMT2A) for autosomal dominant Charcot-Marie-Tooth disease type 2 to chromosome 1p and evidence of genetic heterogeneity// Genomics. 1993a. Vol. 17. P. 370—375.

Ben Othmane K.f Hentati F., Lennon F. et al. Linkage of a locus (CMT4A) for autosomal recessive Charcot-Marie-Tooth disease to chromosome 8// Hum. Molec. Genet. 1993b. Vol. 2. P. 1625—1628. Bethlem J., van Wijngaarden G.K. Benign myopathy with autosomal dominant inheritance: a report on three pedigrees// Brain. 1976. Vol.99. P. 91—100.

Bieber F. R., Hoffman E. P., Amos J. A. Dystrophin analysis in Duchenne muscular dystrophy: use in fetal diagnosis and in genetic counseling//Am. J. Hum. Genet. 1989. Vol. 45. P. 362—367.

Bione S. et al. Transcriptional organization of a 450-kb region of the human X chromosome in Xq28// Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. Vol. 90. P. 10977—10981.

Bione S., Maestrini E., Rivella S. et al. Identification of a novel X-linked gene responsible for Emery-Dreifuss muscular dystrophy// Nature Genet. 1994. Vol. 8. P. 323—327.

Bird T. D., Ott J., Giblett E. R. Linkage of Charcot-Marie-Tooth neuropathy to the Daffy locus on chromosome Ml (Abstr.) Am. J. Hum. Genet. 1980. Vol.32. P. 99A, only.

Bittner R. E., Anderson L. V. В., Burkhardt E. et al. Dysferlin deletion in

SJL mice (SJL-Dysf) defines a natural model for limb girdle muscular dystrophy 2B// Nature Genet. 1999. Vol. 23. P. 141—142.

Blake D.J., Love D.R., Tinsley J. et al. Characterization of a 4.8-kb transcript from the Duchenne muscular dystrophy locus expressed in schwannoma cells// Hum. Mol. Genet. 1992. Vol. 1. P. 103— 109.

Blake D. J.f Schofield J. N., Zuellig R. A. et al. G-utrophin, the autosomal homologue of dystrophin Dpi 16, is expressed in sensory ganglia and brain// Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. Vol. 92. P. 3697—3701.

Blake D. J., Tinsley J. M., Davies К. E. Utrophin: a structural and functional comparison to dystrophin// Brain Pathology. 1996. Vol. 6. P. 37—47.

Bodrug S. E., Burghes A. H. M., Ray P. M., Worton R. G. Mapping of four translocation breakpoints within the Duchenne muscular dystrophy gene//Genomics. 1989. Vol. 4. P. 101—104.

Bolino A., Brancolini V., Bono F. et al. Localization of a gene responsible for autosomal recessive demyelinating neuropathy with focally folded myelin sheaths to chromosome 11q23 by homozygosity mapping and haplotype sharing// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1051— 1054.

Bone L. J., Dahl N., Lensch M. W. et al. X-linked neuropathy: gene localization with DNA probe//Ann. Neurol. 1986. Vol. 20. P. 527— 532.

Bonne G., Di Barletta M. R., Varnous S. et al. Mutations in the gene encoding lamin A/C cause autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy// Nature Genet. 1999. Vol. 21. P. 285—288.

Bonnemann C. G., Modi R.f Noguchi S. et al. Beta-sarcoglycan (A3b) mutations cause autosomal recessive muscular dystrophy with loss

of the sarcoglycan complex// Nature Genet. 1995. Vol. 11. P. 266— 273.

Bonnemann C. G., Passos-Bueno M. R., McNally E. M. et al. Genomic screening for beta-sarcoglycan gene mutations: missense mutations may cause severe limb-girdle muscular dystrophy type 2E (LGMD 2E)//Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1953—1961.

Boyce F. M., Beggs A. H., Feener C, Kunkel, L. M. Dystrophin is transcribed in brain from a distant upstream promoter// Proc. Natl. Acad. Sci. 1991. Vol. 88. P. 1276—1280.

Boyd Y., Cockburn D., Holt S. et al. Mapping of 12 translocation breakpoints in the Xp21 region with respect to the locus for Duchenne muscular dystrophy// Cytogenet. Cell Genet. 1988. Vol. 48. P. 28—34.

Brahe C, Clermont O., Zappata S. et al. Frameshift mutation in the survival motor neuron gene in a severe case of SMA type// Hum. Mol. Gnet. 1996. Vol. 5. P. 1971—1976.

Brais В., Xie Y.-G., Sanson M. et al. The oculopharyngeal muscular dystrophy locus maps to the region of the cardiac alpha and beta myosin heavy chain genes on chromosome 14q11.2-q13// Hum. Mol. Genet. 1995. Vol. 4. P. 429—434.

Brais В., Bouchard J.-R, Xie Y.-G. et al. Short GCG expansions in the

PABP2 gene cause oculopharyngeal muscular dystrophy// Nature Genet. 1998. Vol. 18. P. 164—167.

Brenman J. F., Chao D. S., Xia H., Aldape K., Bredt D. S. Nitric oxide synthase complexed with dystrophin and absent from sceletal muscle in Duchenne muscular dystrophy// Cell. 1995. Vol. 82. P. 743—752.

Brook J. D., McCurach M. E., Harley H. G. et al. Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of trinucleotide (CTG) repeat at the 3-prime end of a transcript encoding a protein kinase family member// Cell. 1992. Vol. 68. P. 799—808.

Brown M. D., Torroni A., Shoffner J. M., Wallace D. C. Mitochondrial tRNA-thr mutation and lethal infantile mitochondrial myopathy//Am. J. Hum. Genet. 1992. Vol. 51. P. 446—447.

Bruijn L. I., Becher M. W.f Lee M. K. et al. ALS-linked SOD 1 mutant

G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD 1-containing inclusions// Neuron. 1997. Vol. 18. P. 327—338.

Bulfield G., Siller W. G.f Wight P. A. L, Moore K. G. X chromosome linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse// Proc. Natl. Acad. Sci. 1984. Vol. 81. P. 1189—1192.

Bulman D. E., Morphy E. G., Zubrzycka-Gaarn E. E.f Worton R. G.,

Ray P. N. Differentiation of Duchenne and Becker muscular dystrophy phenotypes with aminoand carboxy-terminal antisera specific for dystrophin//Am. J. Hum. Genet. 1991. Vol. 48. P. 295— 304.

Bulman D. E. Phenotype variation and newcomers in ion channel disorders//Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 1679—1685.

BurghesA. H. M., Logan C, HuX. etal. AcDNA clone from the Duchenne/ Becker muscular dystrophy gene// Nature. 1987. Vol. 328. P. 434— 436.

Burlet P., Huber C, Bertrandy S. et al. The distribution of SMN protein complex in human fetal tissues and its alteration in spinal muscular atrophy// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 1927—1933

Bushby К. M. D., Beckmann J. S. The limb-girdle muscular dystrophies:

proposal for a new nomenclature// Neuromusc. Disord. 1995. Vol. 5. P. 337—343.

Buxton J., Shelbourne P., Davies J. et al. Detection of an unstable fragment of DNA specific to individuals with myotonic dystrophy// Nature. 1992. Vol. 355. P. 547—548.

Campanelli J. T, Roberds S. L, Campbell K. P., Scheller S. H. A role for dystrophin-associated glycoproteins for and utrophin in agrininduced AChR clustering//Cell. 1994. Vol. 77. P. 663—674.

Celly J., Hamard G., Koulakoff A. et al. Dystrophin gene transcribed from different promotor in neuronal and glial cells// Nature. 1990. Vol. 344. P. 64—65.

Carango P., Noble J. E., Marks H. G.f Funanage V. L. Absence of myotonic dystrophy protein kinase (DMPK) mRNA as a result of a triplet repeat expansion in myotonic dystrophy// Genomics. 1993. Vol. 18. P. 304—308.

Cartegni L, di Barletta M. R.f Barresi R. et al. Heart-specific localization of emerin: new insights into Emery-Dreifuss muscular dystrophy// Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 2257—2264.

Carter T. A., Bonnemann C. G., Wang С. H. et al. A multicopy transcription-repair gene, BTF2p44, maps to the SMA region and demonstrates SMA associated deletions// Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 229—236.

Chamberlain J. S., Gibbs R. A., Ranier J. I., Nguyen P. N., Caskey С. T.

Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification// Nucleic Acids Res. 1988a. Vol.16. P. 11141—11156.

Chamberlain J. S., Pearlman J. A., Muzny D.M. et al. Expression of the murine Duchenne muscular dystrophy gene in muscle and brain// Science. 1988b. Vol. 239. P. 1416—1418.

Chamberlain J. S. The dynamics of dystroglycan// Nature Genet. 1999. Vol. 23. P. 256—258.

Chance P. F, Alderson M. K., Leppig K. A. etal. DNA deletion associated with hereditary neuropathy with liability to pressure palsies// Cell. 1993. Vol. 72. P. 143—151.

Chance P. F., Abbas N., Lensch N. W. et al. Two autosomal dominant neuropathies result from reciprocal DNA duplication/deletion of a region on chromosome 11ll Hum. Mol. Genet. 1994. Vol. 3. P. 223— 228.

Chen J. D., Hejtmanick J. F., Romeo G.et al. A genetic linkage map of five marker loci in and around the Duchenne muscular dystrophy locus//Genomics. 1989. Vol. 4. P. 105—109.

Chen et al. Long-range sequence analysis in Xq28: thirteen known and six candidate genes in 219.4 kb of high GC DNA between the RCP/ GCP and G6PD in Xq28// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 659— 668.

Christodoulou К., Kyriakides Т., Hristova A. H. et al. Mapping of a distal form of spinal muscular atrophy with upper limb predominance to chroosome 7p// Hum. Mol. Genet. 1995. Vol. 4. P. 1629—1632.

Clarke A., Davies К. E., Gardner-Medwin D., Burn J., Hodgson S. V.

Xp21 DNA probe in diagnosis of muscular dystrophy and spinal muscular atrophy// Lancet. 1989. Febr. 25. P. 443.

Clerk A., Morris G. E., Dubowitz V, Davies К. E., Sewry C. A. Destrophinrelated protein, utrophin, in normal and dystrophic human fetal muscle// Histochem. J. 1993. Vol. 25. P. 554—561.

Cobben J. M., van der Steege G., Grootscholten P. M. et al. Deletions of the survival motor neuron gene in unaffected siblings of patients with spinal muscular atrophy//Am. J. Hum. Genet. 1995. Vol. 57. P. 805—808.

Cobo A., Grinberg D., Balcells S. et al. Linkage disequilibrium detected between myotonic dystrophy and anonymous marker D19S63 in the Spanish population// Hum. Genet. 1992. Vol. 89. P. 287—291. Coovert D. D., Le Т. Т., McAndrew P. E. et al. The survival motor neuron protein in spinal muscular atrophy// Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 1205—1214.

Cormier V, Rotig A., Colonna M. et al. Autosomal dominant deletion of the mitochondrial genome in a case of progressive encephalomyopathy// Am. J. Hum. Genet. 1991. Vol. 48. P. 643—648.

Corcos I.A., Lafreniere R.G., Begy C.R. et al. Refined localization of human connexin 32 gene locus, CJB1, to Xq13.1//Genomics. 1992. Vol. 13. P. 479—480.

Cote P. D., Moukhles H., Lindenbaum M.f Carbonetto S. Chimeric mice dificient in dystroglycans develop muscular dystrophy and have disrupted myoneural synapses// Nature Genet. 1999. Vol. 23. P. 338—342.

Cox G. A., Cole N. M., Matsumura K. et al. Overexpression of dystrophin in transgenic mdx mice eliminates dystrophic symptoms without

toxicity// Nature. 1993a. Vol. 364. P. 725—729.

Cox G.. A., Phelps S. F., Chapman V. M., Chamberlain J. S. New mdx mutation disrupts expression of musculo and nonmuscule isoforms

of dystrophin// Nature Genet. 1993b. Vol. 4. P. 87—93.

Cox G.. A., Sunada Y, Campbell K. P., Chamberlain J. S. Dp71 can restore the dystrophin-associated glycoprotein complex in muscle

but fails to prevent dystrophy// Nature Genet. 1994. Vol. 8. P. 333— 339.

Crosbie R. H.f Straub V, Yun H.-Y. et al. Mdx muscle pathology is independent of nNOS perturbation// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 823—829

Dal Canto M. C, Gurney M. E. Development of central nervous system pathology in a murine transgenic model of human amyotrophic lateral sclerosis//Am. J. Pathol. 1994. Vol. 146. P. 1271—1279.

Daniels R. J., Thomas N. H., MacKinnon R. N. et al. Linkage analysis of spinal muscular atrophy//Genomics. 1992. Vol. 12. P. 335—339.

Darras В. T, Blattner P., Harper J. F. et al. Intragenic deletions in 21

Duchenne muscular dystrophy (DMD)/Becker muscular dystrophy

(BMD) families studied with the dystrophin cDNA: location of breakpoints on Hindi 11 and Bgl11 exon-containing fragment maps, meiotic and mitotic origin of the mutations// Am. J. Hum. Genet. 1988. Vol. 43. P. 620—629.

DeChiara Т. M., Bowen D. C, Valenzuela D. M. et al. The receptor tyrosine kinase MuSK is required for neuromuscular junction formation in vivo// Cell. 1996. Vol. 85. P. 501—52.

Deconinck A. E., Rafael J. A., Skinner J. A. et al. Utrophin-dystrophin deficient mice as a model for Duchenne muscular dystrophy// Cell. 1997a. Vol. 90. P. 717—727.

Deconinck A. E., Potter A. C, Tinsley J. M. et al. Postsynaptic abnormalities at the neuromuscular junctions of utrophin-deficient mice//J. Cell. Biol. 1997b. Vol. 136. P. 883—894.

Deconinck N., Tinsley J., De Backer F. et al. Expression of truncated utrophin leads to major functional improvements in dystrophindeficient muscles of mice// Nature Med. 1997c. Vol. 3. P. 1216— 1221.

de Gouyon В. M., Zhao W., Laporte J. et al. Characterization of mutations in the myotubularin gene in twently six patients with X-linked myotubular myopathy// Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 1499— 1504.

Deng H.-X., Hentati A., Tainer J. A. et al. Amyotrophic lateral sclerosis and structural defect in Cu,Zn superoxide dismutase// Science. 1993. Vol. 261. P. 1047—1051.

Dhal N., Samson F, Thomas N. et al. X-linked myotubular myopathy

(MTM1) maps between DXS304 and DXS305, closely linked to the DXS455 VNTR and new, highly informative microsatellite marker (DXS1684)// J. Med. Genet. 1994. Vol. 31. P. 922—924.

Dhal N., Hu L, Chery M. et al. Myotubular myopathy in a girl with a deletion at Xq27-q28 and unbalanced X inactivation assigns the MTM1 gene to 600-kb region//Am. J. Hum. Genet. 1995. Vol. 56. P. 1108—1115.

Dickson G., Love D. R., Davies К. E. et al. Human dystrophin gene transfer: production and expression of a functional recombinant DNA-based gene// Hum. Genet. 1991. Vol. 88. P. 53—58.

Dodson H. C, Piper T. A., Clarke J. D. W., Quinlivan R. M., Dickson G. Dystrophin expression in the hair cells of the cochlea// J. Neurocytology. 1995. Vol. 24. P. 625—632.

D’Souza V. N., Nguyen Т. M., Morris G. E. etal. A novel dystrophin isoform is requered for normal retinal electrophysiology// Hum. Mol. Genet. 1995. Vol. 4. P. 837—842.

Duggan D. J., Gorospe J. R., Fanin M., Hoffman E. P., Angelini C. Mutations in the sarcoglycan genes in patients with myopathy// New Eng. J. Med. 1997. Vol. 336. P. 618—624.

Dunckley M. G., Manoharan M., Villiet P. et al. Modification of splicing in the dystrophin gene in cultured Mdx muscle cells by antisense oligoribonucleotides//Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 1083—1091

Dunnen J. T. D., Grootscholten P. M., Bakker E. et al. Topography of the

Duchenne muscular dystrophy (DMD) gene:FIGE and cDNA analysis of 194 cases reaveals 115 deletions and 13 duplications// Am. J. Hum. Genet. 1989. Vol. 45. P. 835—847.

Eiberg H., Mohr J., Neilsen L. S., Simonsen N. Genetics and linkage relationships of the C3 polymorphism: discovery of C3-Se linkage and assignment of LES-C3-DM-Se-PEPD-Lu synteny to chromosome 19//Clin. Genet. 1983. Vol. 24. P. 159—170.

England S. В., Nicholson L. V. В., Johnson M. A. et al. Very mild muscmlar dystrophy associated with the deletion of 46% of dystrophin// Nature. 1990. Vol.343. P. 180—182.

Epstein C. J., Avraham К. В., Lovett M. et al. Transgenic mice with increased Cu/Zn-superoxide dismutase activity: animal model of dosage effects in Down syndrome// Proc. Natl. Acad. Sci. 1987. Vol. 84. P. 8044—8048.

Ervasti J. M., Campbell K. P. Membrane organization of the dystrophynglycoprotein complex//Cell. 1991. Vol. 66. P. 1121—1131.

Erwin W. G. A pedigree of sex-linked recessive perioneal atrophy// J. Hered. 1944. Vol. 35. P. 24—26.

Essen A. J.f Abbs St., Baiget M. et al. Paternal origin and germ-line mosaicism of deletions and duplications of the dystrophin gene: European study// Hum. Genet. 1992. Vol. 88. P. 249—257.

Fabbrizio D., Latouche J., Rivier F, Hugon G., Mornet D. Re-evaluation of the distribution of dystrophin and utrophin in sciatic nerve// Biochem. J. 1995a. Vol. 312. P. 309—314.

Fabbrizio E., Bonet-Kerrache A. et al. Dystrophin, the protein that promotes membrane resistance//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995b. Vol.213. P. 295—301.

Fananapazir L, Dalakas M. C, Cyran F., Cohn G., Epstein N. D.

Missence mutations in the beta myosin heavy-chain gene cause central core desease in hypertrophic cardiomyopathy// Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. Vol. 90. P. 3993—3997.

Feener C, Boyce F. M., Kunkel L. M. Rapid detection of CA polymorphisms in cloned DNA: application to the 5′ region of dystrophin gene//Am. J. Hum. Genet. 1991. Vol. 48. P. 621—627.

Feero W. G., Wang J., Barany F. et al. Hyperkalemic periodic paralysis: rapid molecular diagnosis and relationships of genotype to phenotype in 12 families// Neurology. 1993. Vol. 43. P. 668—673.

Finocchiaro G., Taroni F., Rocchi M. et al. cDNA cloning, sequence analysis, and chromosomal localization of the gene for human carnitine palmitoyltransferase//Proc. Natl. Acad. Sci. 1991. Vol. 88. P. 661—665

Fischel-Ghodgian N., Bohlman M. C, Prezant T. R. et al. Deletions in blood mitochondrial DNA in Kearns-Sayre syndrome// Pediatr. Res. 1992. Vol. 31. P. 557—560.

Fontaine В., Khurana T. S., Hoffman E. P. et al. Hyperkalemic periodic paralysis and the adult muscle sodium channel alpha-subunit gene//Science. 1990. Vol. 250. P. 1000—1002.

Fontaine В., Vale-Santos J., Jurcat-Rott K. et al. Mapping of the hypokalemic periodic paralysis (HypoPP) locus to chromosome 1q31-q32 in three European families// Nature Genet. 1994. Vol. 6. P. 267—272.

Fougerousse F, Broux O., Richard I. et al. Mapping of a chromosome 15 region involved in limb girdle muscular dystrophy// Hum. Molec.

Genet. 1994. Vol. 3. P. 285—293.

Francis M. J., Nesbit M. A., Theodosiou A. M. et al. Mapping of retrotransposon sequences in the unstuble region surrounding the spinal muscular atrophy locus in 5q13// Genomics. 1995. Vol. 27. P. 366—369.

Francke U., Ochs H. D., de Martinville B. et al. Minor Xp2 chromosome deletion in a male associated with expression of Duchenne muscular dystrophy, chronic granulomatose deseases, retinits pigmentosa, and MvLeod syndrome//Am. J. Hum. Genet. 1985. Vol. 37. P. 250— 267.

Francke U., Darras В. Т., Hersh J. H., Berg В. O., Miller R. G. Brother/ sister pairs affected with early-onset, progressive muscular dystrophyimolecular studies reveal etiologic heterogeneity//Am. J. Hum. Genet. 1989. Vol. 45. P. 63—72.

Fu Y.-H., Pizzuti A., Fenwick R. G. et al. An unstable triplet repeat in a gene related to myotonic muscular dystrophy// Science. 1992. Vol. 255. P. 1256—1258.

Fu Y.-H., Friedman D. L, Richards S. et al. Decreased expression of myotonin-protein kinase messenger RNA and protein in adult form of myotonic dystrophy// Science. 1993. Vol. 260. P. 235—238.

Fu K., Hartlen R., Johns T. et al. A novel heteroplasmic tRNAIeu(CUN) mtDNA point mutation in a sporadic patient with mitochondrial encephalomyopathy segregates rapidly in skeletal muscle and suggests an approuch to therapy// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1835—1840.

Fuchs E., Cleveland D. A structural scaffolding of intermediate filaments in health and disease// Sci. 1998. Vol. 279. P. 514—519.

Fukujama F, Osawa M., Suzuki H. Congenital progressive muscular dystrophy of the Fukujama type clinical, genetic and pathological considerations// Brain Dev. 1981. Vol. 3. P. 1—30.

Furukawa K., Pante N., Aebi U.f Gerace L. Clonning of a cDNAfor laminaassociated polypeptide 2 (LAP2) and identification of regions that specify targeting to the nuclear envelope// EMBO J. 1995. Vol. 14. P. 1626—1636.

Gache Y, Chavanas S., Lacour J. P. et al. Defective expression of plectin/

HD1 in epidermolysis bullosa simplex associated with muscular dystrophy//J. Clin. Invest. 1996. Vol. 97. P. 2289—2298.

Gal A., Mucke J., Theile H. et al. X-linked dominant Charcot-Marie-Tooth disease: suggestion of linkage with a cloned DNA sequence from proximal Xq// Hum. Genet. 1985. Vol. 70. P. 38—42.

Gautam M., Noakes P. G., Mudd J. et al. Failure of postsynaptic specialization to develop at neuromuscular junctions of rapsyndeficient mice// Nature. 1995. Vol. 377. P. 232—236.

Gautron C, Daegelen D.f Mennecier F. et al. Molecular mechanisms of

McArdle’s disease (muscle glycogen phosphorylase deficiency)// J. Clin. Invest. 1987. Vol. 79. P. 275—281.

Gavrilov D. K., Shi X., Das K., Gilliam Т. C, Wang С. H. Differential SMN2 expression associated with SMA severity// Nature Genet. 1998. Vol. 20. P. 230—231.

Gee S. H., Montanaro R, Lindenbaum M. H., Carbonetto S. Dystroglycanalpha, a dystrophin-associated glycoprotein is a functional agrin receptor// Cell. 1994. Vol. 77. P. 675—686.

George A. L, Ledbetter D. H.f Kallen R. G., Barchi R. L. Assignment of a human skeletal muscle sodium channel alpha-subunit gene (SCN4A) to 17q23.1-25.3//Genomics. 1991. Vol. 9. P. 555—556.

George A. L, Komisarof J., Kallen R. G., Barchi R. L. Primary structure of the adult human skeletal muscle voltage-dependent sodium channel//Ann. Neurol. 1992. Vol. 31. P. 131—137.

George A. L, Crackower M. A., Adballa J. A. et al. Molecular basis of

Thomsen’s disease (autosomal dominant myotonia congenita)// Nature Genet. 1993. Vol. 3. P. 305—310.

Gesemann M.f Cavalli V, Denzer A. J. Alternative splicing of agrin alters its binding to heparin, dysroglycan, and the putative agrin receptor// Neuron. 1996. Vol.16. P. 755—767.

Giannelli, F. Theoretical expectations for deletional mutations in Duchenne muscular dystrophy//Am. J. Med. Genet. 1988. Vol. 31. P. 991—992.

Gilbert J. R., Stajich J. M., Wall S. et al. Evidence for heterogeneity in facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD)// Am. J. Hum. Genet. 1993. Vol. 53. P. 401—408.

Gilbert R., et al. Efficient utrophin expression following adenovirus gene transfer in dystrophic muscle// Biochem. Biophys. Res. Com. 1998.

Vol. 242. P. 244—247.

Ginjaar H. В., Bakker Е., Dunnen J. Т. et al. Immunological study of dystrophin in Duchenne fetus// Lancet. 1989. Nov. 18. P. 1212— 1213.

Goebrl H. H., Anderson J. R.f Hubner C. et al. Congenetal myopathywith excess of thin filaments//Neuromusc. Disord. 1997. Vol. 7. P. 160— 168.

Goldfarb L. G., Park K.-Y, Cervenakova S. et al. Missense mutations in desmin associaed with familial cardiac and skeletal myopathy// Nature Genet. 1998. Vol. 19. P. 402—403.

Goonewardena P., Welihinda J., Anvert M. et al. A linkage study of the locus for X-linked Charcot-Marie-Tooth disease// Clin. Genet. 1988. Vol. 33. P. 435—440.

Gorecki D. C, Monaco A. P., Deny J. M. J. Expression of four alternative dystrrophin transcripts in brain regions regulated by different promoteers//Hum. Mol. Genet. 1992. Vol.1 (7). P. 505—510.

Goto Y, No пака l.f Horai S. A mutation in the tRNA-leu (UUR) gene associated with the MELAS subgroup of mitochondrial encephalomyopathies// Nature. 1990. Vol. 348., P. 651—653.

Goto Y., Horai S. Matsuoka T. et al. Mitochondrial myopathy, encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes (MELAS): of a correlative study of the clinical features and mitochondrial DNA mutation// Neurology. 1992. Vol. 42. P. 545— 550.

Gourdon G., Radvanyi F., Lia A.-S. et al. Moderate intergenerational and somatic instability of a 55-CTG repeat in transgenic mice// Nature Genet. 1997. Vol. 15. P. 190—192.

Grady R. M., Teng H., Nichol M. C. et al. Skeletal and cardiac myopathies in mice lacking utrophin and dystrophin: a model for Duchenne muscular dystrophy//Cell. 1997a. Vol.90. P. 729—738.

Grady R. M., Merlie J. P., Sanes J. R. Subtle neuromuscular defects in utrophin-deficient mice//J. Cell Biol. 1997b. Vol. 136. P. 871—882.

Greenberg D. S., Sunada Y., Campbell K. P., Yaffe D., Nudel U. Exogenous Dp71 restores the dystrophin associated proteins but does not alleviate muscle damage in mdx mice// Nature Genet. 1994. Vol. 8. P. 340—344.

Greenberg D. S.f Schatz Y, Levy Z. et al. Reduced levels of dystrophin associated proteins in the brain of mice deficient for Dp71// Hum.

Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1299—1301.

Grether M. E., Abrams J. M., Agapite J., White K., Steller H. The head involution defective gene of Drosophila melanogaster functions in programmed cell death// Genes Develop. 1995. Vol. 9. P. 1694— 1708.

G riff its L. R.f Zwi M. В., McLeod J. G., Nicholson G. A. Linkage studies on Charcot-Marie-Tooth neuropathy type Ml (Abstr.) Cytogenet. Cell Genet. 1987. Vol. 46. P. 624 only.

G riff its L. R., Zwi M. В., McLeod J. G., Nicholson G. A. Chromosome I linkage studies in Charcot-Marie-Tooth neuropathy type Ml Am. J. Hum. Genet. 1988. Vol. 42. P. 756—771.

Guern E., Magi S.f Parry G. et al. New connexin 32 mutations associated with X-linked Charcot-Marie-Tooth disease// Neurology. 1995, Vol.45. P. 1863—1866.

Guiloff R. J., Thomas P. K., Contreras M. et al. Evidence for linkage of type I hereditary motor and sensory neuropathy to the Daffy locus on chromosome 1//Ann. Hum. Genet. 1982, Vol. 46. P. 25—27.

Guimera J., Casas C, Pucharcos C. et al. A human homologue of

Drosophila minibrain (MNB) is expressed in the neuronal regions affected in Down syndrome and maps to the critical region// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1305—1310.

Haan E. A., Freemantle C. J., McCure J. A., Friend K. L., Mulley J. C.

Assigment of the gene for central core desease to chromosome 19// Hum. Genet. 1990. Vol. 86. P. 187—190.

Hahnen E., Schonling J., Rudnik-Schoneborn S. et al. Missence mutations in exon 6 of the survival motor neuron gene in patients with spinal muscular atrophy (SMA)//Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 821—825.

Harding A. E., Petty R. К. H., Morgan-Hughes J. A. et al. Mitochondrial myopathies: a genetic study of 71 cases// J. Med. Genet. 1988. Vol. 25. P. 528—535.

Harley H. G., Brook J. D., Flojd J. et al. Detection of linkage disequilibrium between the myotonic dystrophy locus and anew polymorphic DNA marker// Am. J. Hum Genet. 1991. Vol. 49. P. 68—75.

Harley H. G., Brook J. D., Rundle S. A. et al. Expansion of an unstable DNA region and phenotypic variation in myotonic dystrophy// Nature.

1992. Vol. 355. P. 545—546.

18 Заказ № 170

Harris S.f Moncrieff C, Johnson K. Myotonic dystrophy: will the real gene please step forward Ml Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1417—1423.

Hayasaka K., Himuro M., Wang Y. et al. Structure and chromosomal localization of the gene encoding the human myelin protein zero (MPZ)//Genomics. 1993a. Vol. 17. P. 755—758.

Hayasaka K., Himuro M., Sato W. et al. Charcot-Marie-Tooth neuropathy type IB is assotiated with mutations of the myelin P(O) gene// Nature Genet. 1993b. Vol. 5. P. 31—34.

Hayashi Y. K.f Chou F.-L, Engvall E. et al. Mutations in the integrin alpha7 gene cause congenetal myopathy// Nature Genet. 1998. Vol. 19. P. 94—97.

Hentati A., Lamy C, Melki J. et al. Clinical and genetic heterogeneity of Charcot-Marie-Tooth disease// Genomics. 1992a. Vol. 12. P. 155— 157.

Hentati A., Bejaoui K., Pericak-Vance M. A. et al. The gene locus for one from of juvenile amyotrophic lateral sclerosis maps to hromosome 211 (Abstr.) Am. J. Hum. Genet. 1992b. Vol. 51 (suppl.). P. A33 only.

Hentati A., Bejaoui K., Pericak-Vance M. A. et al. Linkage of recessive familial amyotrophic lateral sclerosis to chromosome 2q33-q35// Nature Genet. 1994. Vol. 7. P. 425—428.

Helbling-LeclercA.,fehang X.,Topaloglu H. et al. Mutations in the laminin alpha 2-chain gene (LAMA2) cause merosin-deficient congenetal muscular dystrophy// Nature Genet. 1995. Vol. 11. P. 216—218.

Heringham W. P. Muscular atrophy of the perioneal type affecting many members of a family// Brain. 1889. Vol. 11. P. 230—236.

Hewitt J. E., Lyle R.f Clark L. H. et al. Analysis of the tandem repeat locus D4Z4 associated with facioscapulohumeral muscular dystrophy//Hum. Mol. Genet. 1994. Vol. 3. P. 1287—1295.

Hillaire D., Leclerc A., Faure S., et al. Localization of mersoin-negative congential muscular dystrophy to chromosome 6q2 by homozygosity mapping//Hum. Mol. genet. 1994. Vol. 3. P. 1657—1661.

Holt I. L., Harding A. E.f Morgan-Hughes J. A. et al. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies// Nature. 1988. Vol. 331. P. 717—719.

Hoogendijk J. R, Hensels G. W., Gabreels-Festen A.A.W.M. et al. De novo mutation in hereditary motor and sensory neuropathy type Ml Lancet. 1992. Vol. 339. P. 1081—1082.

Hoogendijk J. E., Janssen E. A. M.f Gabreels-Resten A. A. W. M. et al. Allelic heterogeneity in hereditary motor and sensory neuropathy type 1a (Charcot-Marie-Tooth disease type la)// Neurology. 1993. Vol. 43. P. 1010—1015.

Howard P. L., Dally G. Y, Wong M. H. et al. Localization of dystrophin isoform Dp71 to the inner limiting membrane of the retina suggests a unique functional contribution of Dp71 in the retina// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 1385—1391

Hu L. J.f Laporte J., Kress W. et al. Deletion in Xq28 in two boys with myotubular myopathy and abnormal genital development define a new contiguous gene syndrome in a 430 kb region// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 139—143.

Ни X., Burghes A. H. M., Bulman D. E., Ray P. N., Worton R. G. Evidence for mutation by unequal sister chromatid exchange in the Duchenne muscular dystropy gene// Ami. J. Hum. Genet. 1989. Vol. 44. P. 855—863.

HurkoO., Hoffman E. P., McKee L.f Jhons D. R., Kunkel L. M. Dystrophin analysis in clonal myoblasts derived from a Duchenne muscular dystrophy carrier//Am. J. Hum. Genet. 1989. Vol. 44. P. 820—826. Huxley C, Passage E., Manson A. et al. Construction of a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 1A by pronuclear injection of human YAC DNA// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 563—569.

Huxley C, Passage E., Robertson A. M.f Youl B. Correlation between varying levels of PMP22 expression and the degree of demyelination and reduction in nerve conduction velocity in transgenic mice// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 449—458

Ibragimov-Beskrovnaya O., Ervasti J.M., Leveille C.J. et al. Primary structure of dystrophin-asociated glycoproteins linking dystrophin to the extracellular matrix// Nature. 1992. Vol. 355. P. 696—702.

Ibragimov-Beskrovnaya O., Milatovich A., Ozcelik T. et al. Human dystroglycan: sceletal muscle cDNA, genomic structure, origin of tissue-specific forms and chromosomal localization// Hum. Mol.

Genet. 1993. Vol. 2. P. 1651—1657.

Im W. В., Phelps S. F., Copen E. H. et al. Differential expression of dystrophin isoforms in strains of mdx mice with different mutations// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol 5. P. 1149—1153.

lonasescu V. V., Trofatter J., Haines J. L. et al. X-linked recessive Charcot-Marie-Tooth neuropathy: clinical and genetic study// Muscle Nerve. 1992. Vol. 15. P. 368—373.

lonasescu V. V, lonasescu R., Searby C. Screening of dominantly inherited Charcot-Marie-Tooth neuropathy// Musle Nerve. 1993. Vol. 16. P. 1232—1238.

lonasescu V. V. Charcot-Marie-Tooth neuropathy: from clinical description to molecular genetics// Musle Nerve. 1995. Vol. 18. P 267—275. lonasescu V., Searby C, Sheffield V. C. et al. Autosomal dominant Charcot-Marie-Tooth axonal neuropathy mapped on chromosome 7p (CMT2D)//Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1373—1375.

Isozumi K., DeLong R., Kaplan J. et. al. Linkage of scapuloperoneal spinal muscular atrophy to chromosome 12q24.1-q24.31//Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1377—1382.

Iwasaki H., Stewart P. W., Dilley W. G. et al. A minisatellite and microsatellite polymorphism within 1.5 kb at the human muscle glycogen phosphorylase (PYGM) locus can be amplified by PCR and have combined informativeness of PIC 0.95// Genomics. 1992. Vol. 13. P. 7—15.

Jaksch M., et al. A systematic mutation screen of 10 nuclear and 25 mitochondrial candidate genes in21 patients with cytochrome с pxydase (COX) deficiency shows tRNA(Ser)(UCN) mutations n subgroup with syndromal encephalopathy// J. Med. Genet. 1998. Vol. 35. P. 895—900.

Jansen G., Mahadevan M., Amemia C. et al. Characterization of the myotonic dystrophy region predicts multiple protein isoformencoding mRNAs// Nature Genet. 1992. Vol. 1. P. 261—238.

Jansen G., Bachner D., Coerwinkel M. et al. Structural organization and developmental expression pattern of the mouse Wd-repeat gene Dmr-N9 immediately upstream of the myotonic dystrophy// Hum. Mol. Genet. 1995. Vol. 4. P. 843—852.

Jansen G., Groenen P. J. T. A., Bachner D. et al. Abnormal myotonic dystrophy protein kinase levels produce only mild myopathy in mice// Nature Genet. 1996. Vol. 13. P. 316—324.

Jardine P. E.,Upadhyayava M., Maynard J., et al. A scapular onset muscular dystrophy without facial involement: possible allelism with facioscapulohumeral muscular dystrophy// Neuromusc. Disord. 1994. Vol. 4. P. 477—482.

Jobsis G. J., Barth P. G., Boers J. M. et al. Bethlem myopathy: clinical and genetic aspects// Neurology. 1995. Vol. 45. P. 881 S.

Jobsis G. J., Barth P. G., Boers J. M. et al. Genetic localization of Bethlem myopathy// Neurology. 1996a. Vol. 46. P. 779—782.

Jobsis G. J., Keizers H., Vreijling J. P. et al. Type VI collagen mutations in Bethlem myopathy, an autosomal dominant myopathy with contractures// Nature Genet. 1996b. Vol. 14. P. 113—115.

Johns D. R., Rutledge S. L, Stine О. C, Hurko O. Direct repeated sequences associated with pathogenic of mitochondrial DNA deletions// Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. Vol. 86. P. 8059—8062.

Jones С. Т., Brock D. J. H., Chancellor A. M., WArlow C. P., Swingler

R. J. Cu/Zn superoxide dismutase (SOD1) mutations and sporadic amyotrophic lateral sclerosis// Lancet. 1993. Vol. 342. P. 1050— 1051.

Jurkat-Rott K., Lehmann-Horn R, Elbaz A. et al. A calcium channel mutation causing hypokalemic periodic paralysis// Hum Mol. Genet.

            1994. Vol.3. P. 1415—1419.                                                                                                  (

Kameya S., Araki E., Katsuki M. et al. Dp260 disrupted mice revealed prolonged implicit time of the b-wave in ERG and loss of accumulation of [beta]-dystroglycan in the outer plexiform layer of the retina//Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 2195—2203

Kaush K.f Lehmann-Horn R, Janka M. et al. Evidence for linkage of the central core desease locus to the proximal long arm of human chromosome 19//Genomics. 1991. Vol. 10. P. 765—769.

Klamut H. J., Bosnoyan-Collins L. O., Worton R. G., Ray P. N., Davis H. L. Identification of a transcriptional enhancer within muscle intron 1 of the human dystrophin gene// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1599—1606.

Klein C. J., Coovert D. D., Bulman D. E. et al. Somatic reversion/ suppression Duchenne muscular dystrophy (DMD): evidence supporting a frame-restoring mechanism in rare dystrophin-positive fibers//Am. J. Hum. Genet. 1992. Vol. 50. P. 950—959.

Klesert Т. R., Otten A. D., Bird T. D. et al. Trinucleotide repeat expansion at the myotonic dystrophy locus reduces expression of DMAHP// Nature Genet. 1997. Vol. 17. P. 402—406.

Koch M. C, Ricker K., Otto M. et al. Confirmation of linkage of hyperkalemic periodic paralysis to chromosome 17//J. Med. Genet. 1991.28. P. 583—586.

Koch M. C, Steinmeyer K.f Lorenz C. et al. The skeletal muscle chloride channal in dominant and recessive human myotonia//Science. 1992. Vol. 257. P. 797—800.

Koch M. C, Ricker K., Otto M. et al. Evidence for genetic homogeneity in autosomal recessive generalized myotonia (Becker)// J.Med. Genet. 1993. Vol. 30. P. 914—917.

Koch M. C, Baumbach K., George A. L, Ricker K. Paramyotonia congenita without paralysis on exposure to cold: a novel mutation in the SCN4A gene (Val1293lle)// Neuroreport. 1995. Vol. 6. P. 2001—2004.

Koenig M., Beggs A. H., Moyer M. et al. The molecular basis for

Duchenne versus Becker muscular dystropy: correlation with type of deletion//Am. J. Hum. Genet. 1989. Vol. 45. P. 498—506.

Koenig M., Hoffman E. P., Bertolsln C. J. et al. Complete cloninig of the

Duchenne muscular dystrophy (DMD) cDNA and preliminary genomic organization of the DND gene in normal and affected individuals// Cell. 1987. Vol. 50. P. 509—517.

Koenig M.f Monaco T, Kunkel L.M. The complete sequence of dystropin predicts a rod-shaped cytoskeletal protein// Cell. 1988. Vol. 53. P. 219—228.

koob M. D., Moseley M. L, Schut L. J. et al. An untraslated CTG expansion causes a novel form of spinocerebellar ataxia (SCA8)// Nature Genet» 1999. Vol. 21. P. 379—384.

Kubisch C, Schmidt-Rosel T, Fontaine B. et al. CIC-1 chloride channel mutations in myotonia congenita: variable penetrance of mutations shifting the voltage dependence// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 1753—1760

Kulkens T, Bolhuis P. A., Wolterman R. A. et al. Deletion of the serin 34 codon from the major peripheral myelin protein P(O) gene in CharcotMarie-Tooth disease type IB// Nature Genet. 1993. Vol. 5. P. 35— 39.

Kumar-Singh R., Chamberlain J. S. Encapsidated adenovirus minichromosomes allow delivery and expression of a 14 kb dystrophin cDNAto muscle cells// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 913—921.

Kunkel L. M.f Monaco A. P., Middlesworth W., Ochs H. D., Latt S. A.

Specific cloning of DNA fragments absent from the DNA of a male patient with an X chromosome deletion// Proc. Natl. Acad. Sci. 1985. Vol. 82. P. 4778—4782.

Kunst С. В., Mezey E., Browstein M. J., Patterson D. Mutations in SOD1 associated with amyotrophic lateral sclerosis cause novel protein interactions// Nature Genet. 1997. Vol. 15. P. 91—94.

Kwon J. L, Elliott J. L, Woon-chee Y. et al. Assignment of a second Charcot-Marie-Tooth type II locus to chromosome 3q//Am. J. Hum. Genet. 1995. Vol. 57. P. 853—858.

Laing N. G., Majda В. T, Akkari P. A. et al. Assignment of a gene (NEM1) for autosomnal dominant nemaline myopathy to chromosome 1// Am. J. Hum. Genet. 1992. Vol. P. 50, 576—583.

Laing N. G.f Wilton S. D., Akkari P. A. et al. A mutation in the alpha tropomyosin gene ТРМЗ associated with autosomal dominant nemaline myopathy// Nature Genet.. 1995. Vol. 9,. P. 75—79.

Lakich D., Kazazian H. H., Antonarakis St. E., Gitschier J. Inversion disrupting the factor VIII gene are common cause of sever haemophilia N1 Nature Genet. 1993. Vol. 5. P. 236—241.

Lalvani A. K., Brister J. R., Fex J. et al. A new nonsyndromic X-linked sensorineural hearing inpairment linked to Xp21.2//Am.J. Hum. Genet. 1994. Vol. 55. P. 685—694.

Lamandi S. R., Bateman J. F.f Hutchison W. et al. Reduced collagen VI causes Bethlem myopathy: a heterozygous COL6A1 nonsense

mutation results in mRNA decay and functional haploinsufficiency// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 981—989

Land J. M., Morgan-Hughes J. A., Clark J. B. et al. Mitochondrial myopathies: biochemical studies revealing a deficiency of NADHcytochrome b reductase activity// J. Neurol. Sci. 1981. Vol. 50. P. 1—13.

Laporte J.f Hu L. J., Kretz C. et al. A gene mutated in X-linked myotubular myopathy defines a new putative tyrosine phosphatase family conserved in yeast// Nature Genet. 1996. Vol. 13. P. 175—182.

Laporte J., Guiraud-Chaumeil C, Vincent M.-C. et al. Mutations in the MTM1 gene implicated in X-linked myotubular myopathy// Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 1505—1511.

Laporte J., Blondeau F., Buj-Bello A. et al. Characterization of the myotubularin dual specificity phosphatase gene family from yeast

to human// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 1703—1712

Lebo R. V., Gorin F., Fletterick R. J. et al. High-resolution chromosome sorting and DNA spot-blot analysis assign McArdle’s syndrome to chromosome 11//Science. 1984. Vol. 225. P. 57—59.

Lebo R. V. and 39 others. Chromosome I Charcot-Marie-Tooth locus in Fc-gamma-RII gene region// (Abstr.). Am. J. Hum. Genet. 1989. Vol. 45 (suppl.). P.A148 only.

Lebo R. V, Anderson L. A., DiMauro S. et al. Rare McArdle disease locus polymorphic site on 11q13 contains CpG sequence// Hum. Genet. 1990. Vol. 86. P. 17—24.

Lebo R. V, Lynch E. D., Wiegant J. et al. Multicolor fluorescence in situ hibridization and pulsed field electrophoresis dissect CMT1В gene region// Hum. Genet. 1991. Vol. 88. P. 13—20.

Lebo R. V., Lynch E. D., Bird T. D. et al. Multicolor in situ hibridization and linkage analysis order Charcot-Marie-Tooth type I (CMT1A) gene-region markers//Am. J. Hum. Genet. 1992. Vol. 50. P. 42— 55.

Lederfein D., Levy Z., Augier N. et al. A 71-kilodalton protein is a

Duchenne muscular dystrophy gene major product of the in brain and other nonmuscle tissue// Proc. Natl. Acad. Sci. 1993a. Vol. 89. P. 5346—5350.

Lederfein D.f Yaffe D., Nudel U. A housekeeping type promotor, located in the 3-prime region of the Duchenne muscular dystrophy gene, controls the expression of Dp71, a major product of the gene// Hum. Mol. Genet. 1993b. Vol. 2. P. 1883—1888.

Lefebvre S., Burglan L., Reboullet S. et al. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene// Cell. 1995. Vol. 80. P. 165—185.

Lefebvre S., Bbrglen L., Frfiza J. et al.The role of the SMN gene in proximal spinal muscular atrophy// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 1531—1536.

LeGuern E., Sturtz F, Gugenheim M. et al. Detection of deletion within

17p11.2 in 7 French families with hereditary neuropathy with liability

to pressure palsies (HNPP)// Cytogen. Cell Genet. 1994. Vol. 65. P. 261—264.

LeGuern E., Gouider R., Ravise N. et al. A de novo case of hereditary neuropathy with liability to pressure palsies (HNPP) of material origin: a new mechanism for deletion in 17p11.2111 Hum. Mol. Genet. 1996a. Vol.5. P. 103—106.

LeGuern E., Guilbot A., Kessali M. et al. Homozygosity mapping of an autosomal recessive form of demyelinating Charcot-Marie-Tooth disease to chromosome 5q23-q33//Hum. Mol. Genet. 1996b. Vol. 5. P. 1685—1688.

LehesjokiA.-E., Sankila E.-M., Miao J. etal. X-linked neonatal myotubular myopathy: one recombination detected with four polymorphic DNA markers from Xq28//J. Med. Genet. 1990. Vol. 27. P. 288—291.

Lehmann-Horn R, Kuther G., Ricker K. et al. Adynamia episodica hereditaria with myotonia: a non-inactivating sodium current and the effect of extracellular pH// Muscle Nerve. 1987. Vol. 10. P. 363— 374.

Lehmann-Horn R, Rudel R., Ricker K. Workshop report: Non-dystrophic myotonias and periodic paralysis// Neuromusc. Disord. 1993. Vol. 3. P. 161—168.

Lein L. L., Boyce F. M., Kleyn P. et al. Mapping of a gene encoding a dystrophin cross-reactive protein in close proximity to the spinal muscular atrophy locus//Am. J. Hum. Genet. 1991. Vol. 49 (suppl.). P. 412 only.

Lemke G., Axel R. Isolation and sequence of а с DNA encoding the major structural protein of peripheral myelin// Cell. 1985. Vol. 40. P. 501—508.

Lemmers R. J. L. R, van der Maarel S. M., van Deutekom J. С. T. et al. Interand intrachromosomal sub-telomeric rearrangements on 4q35: implications for facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) aetiology and diagnosis// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 1207— 1214.

Lenk U., Oexle K., Voit T. et al. A cystein 3340 substitution in the dystroglycan-binding domainof dustrophin associated with Duchenne muscular dystrophy, mental retardation and absence of the ERG b-wave// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 973—975.

Lia A.-S., Seznec H., Hofmann-RadvanyM H. et al. Somatic instability of the CTG repeat in mice transgenic for the myotonic dystrophy region

is age dependent but not correlated to the relative intertissue

transcription levels and proliferative capacities // Hum. Mol. Genet.1998. Vol.7. P. 1285—1291.

Liechti-Gallati S., Koenig M., Kunkel LM. et al. Molecular deletion patterns in Duchenne and Becker type muscular dystrophy// Hum. Genet. 1989. Vol. 81. P. 343—348.

Lim L. E., Duclos F., Broux O. et al. Beta-sarcoglycan: characterization and role in limb-girdle muscular dystrophy linked to 4q12// Nature Genet. 1995. Vol. 11. P. 257—265.

Liu J., Aoki M., Ilia I. et al. Dysferlin, a novel skeletal muscle gene, is mutated in Miyoshi myopathy and limb girdle muscular dystrophy// Nature Genet. 1998. Vol. 20. P. 31—36.

Liu Q., Dreyfuss G. A novel nuclear structure containing the survival of motor neurons protein// EMBO J. 1996. Vol. 15. P. 3555—3565.

Lorson C. L., Androphy E. J. The domain encoded by exon 2 of the survival motor neuron protein mediates nucleic acid binding// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 1269—1275.

Lorson C. L., Strasswimmer J., Yao J.-M. et al. SMN oligomerization defect correlate with spinal muscular atrophy severity// Nature Genet. 1998. Vol. 19. P. 63-66.

Lupski J. R., Montes de Oca-Luna R., Slaugenhaupt S. et al. DNA duplication associated with Charcot-Marie-Tooth disease type \NI Cell. 1991. Vol. 66. P. 219—232.

Mahadevan M. S., Amemiya C, Jaansen G. et al. Structure and genomic sequence of the myotonic dystrophy (DM kinase) gene// Hum. Mol. Genet. 1993. Vol. 2. P. 299—304.

Mahadevan M. S., Komeluk R. G., Roy N., McKenzie A., Ikeda J.-E. SMA genes: deleted and duplicated// Nature Genet. 1995. Vol. 9. P. 112—113.

Malhotra S. В., Hart K. A., Klamut H. J. et al. Frame-shift deletions in patients with Duchenne and Becker muscular dystrophy// Science. 1988. Vol. 242. P. 755—759.

Manilal S., thi Man N., Sewry C. A., Morris G. E. The Emery-Dreifuss muscular dystrophy protein, emerin, is a nuclear membrane protein// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 801—808.

Manilal S., Recan D., Sewry C. A. et al. Mutations in Emery-Dreifuss muscular dystrophy and their effects on emerin protein expression// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 855—864.

Martorell L, Martinez J. M., Carey N.f Johnson K., Baiget M. Comparison of CTG repeat length expansion and clinical progression of myotonic dystrophy over a five year period// J. Med. Genet. 1995. Vol.» 32. P. 593—596.

Martorell L.f. Monckton D. G., Gamez J.et al. Progression of somatic CTG repeat length heterogeneity in the blood cells of myotonic dystrophy patients// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 307—312.

Mathews K. D.f Mills K. A., Leysens N. J. et al. Characterization of the facioscapulohumeral dystrophy locus on 4q35// (Abstract). Am. J. Hum. Genet. 1991. Vol. 49 (suppl.). P. 350 only.

Matsumura K.f Tome F. M. S.f Collin H. Deficiency 50K dystrophinassociated glycoprotein in severe childhood autosomal recessive muscular dystrophy// Nature. 1992. Vol. 359. P. 320—322.

Matsumura K., Nonaka I., Campbell K. P. Abnormal expression of dystrophin-associated proteins in Fukujama-type congenital muscular dystrophy// Lancet. 1993. Vol. 341. P. 521—522.

Matsuo M. Duchenne/Becker muscular dystrophy: from molecular diagnosis to gene therapy// Brain Dev. 1996. Vol.18(3). P. 167— 172.

Mattei M.-G.f Castella-Escola J., Ojicius D. et al. In situ mapping of the phosphoglycerate mutase muscular form to the human chromosome 711 (Abstract). Cytognet. Cell Genet. 1989. Vol. 51. P. 1041 only.

Mayer U.f et al. Absence of integrin alpha 7 causes a novel form of muscular dystrophy// Nature Genet. 1997. Vol. 17. P. 318—323.

McClatchey A. I., McKenna-Yasec D., Cros D. et al. Novel mutations in families with unusual and variable disorders of the skeletal muscle sodium channel// Nature Genet. 1992. Vol. 2. P. 148—152.

McNally E. M., Yoshida M., Mizuno Y, Ozawa E., Kunkel L. M. Human adhalin is alternatively spliced and gene is located on chromosome 17p21// Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. Vol. 91. P. 9690—9694.

McNally E. M.f Duggan D., Gorospe J. R. et al. Mutation that disrupt the carboxyl-terminus of gamma-sarcoglycan cause muscular dystrophy// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1841—1847.

McNally E. M., de Moreira E., Duggan D. J. et al. Caveolin-3 in muscular dystrophy// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 871—877.

Melki J., Lefebvre S., Burglan L. et al. De novo and inherited deletions of the 5q13 region in spinal muscular atrophy// Science. 1994. Vol. 264. P. 1474—1477.

Mercuri E., Muntoni F.f Berardinelli A. et al. Somatosensory and visual evoked potentials in congenital muscular dystrophy: correlation with MRI changes and muscle merosin status// Neuropediatrics. 1995. Vol. 26. P. 3—7.

Metzinger L., Blake D. J., Squier M. V. et al. Dystrobrevin deficiency at the sarcolemma of patients with muscular dystrophy// Hum. Mol.

Genet. 1997. Vol. 6. P. 1185—1191.

Michalak M., Fu S. Y, Milner R.E. et al. Phosphorylation of the carboxylterminal region of dystrophin// Biochem. Cell Biol. 1996. Vol. 74(4). P. 431—437.

Miciak A., Keen A., Jadayel D., Bundey S. Multiple mutation in an extended Duchenne muscular dystrophy family// J. Med. Genet. 1992. Vol. 29. P. 123—126.

Middleton-Price H. R., Harding A. E., MonteiroC, Berciano J., Malkolm

S. Linkage of hereditary motor and sensory neuropathy type I to the pericentromeric region of chromosome 17//Am. J. Hum. Genet. 1990.Vol.46. P. 92—94.

Milasin J., Muntoni F.f Severini G. M. M. et al. A point mutation in the 5′ splice site of the dystrophin gene first intron responsible for X-linked dilated cardiomyopathy// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 73— 79.

Minetti C, Sotgia F., Bruno С et al. Mutations in the caveolin-3 gene cause autosomal dominant limb-girdle muscular dystrophy// Nature Genet. 1998. Vol. P. 365—368.

Minoletti F., Colombo I., Liras Martin A. et al. Localization of the human gene for carnitine palmitoyltransferase to 1p13-p11 by nonradioactive in situ hybridization// Genomics. 1992. Vol. 13. P. 1372—1374.

Mitrani-Rosenbaum S.,ArgovZ., BlumenfeldA. et al. Hereditary inclusion body myopathy maps to chromosome 9p1-q1// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 159—163.

Monaco T. Dystrophin, the protein product of the Duchenne/Becker muscular dystrophy gene//TIBS. 1989. Vol. 14. P. 412—415.

Monaco Т., Kunkel L M. Cloning of the Duchenne/Becker muscular dystrophy locus//Advances in Hum. Genet. 1988. Vol. 17. P. 6 1 — 98.

Monckton D. G., Coolbaugh M. I., Ashizawa K.T., Siciliano M.J.,

Caskey С. T. Hypermutable myotonic dystrophy CTG repeats in transgenic mice// Nature Genet. 1997. Vol.15. P. 193—196.

Moraes С. Т., DiMauro S., Zeviani M. et al. Mitochondrial DNA deletions in progressive external ophthalmoplegia and Kearns-Sayre syndrome// New Engl. J. Med. 1989. Vol. 320. P. 1293—1299.

Morisaki Т., Gross M., Morisaki H. et al. Molecular basis of AMP deaminase deficiency in skeletal muscle// Proc. Nat. Acad. Sci. 1992. Vol.89. P.6457—6461.

Morisaki Т., Morisaki H., Newby L. K.f Holmes E. W. Alternative splicing: A mechanism for phenotypic rescue of a common inherited defect//J. Clin. Invest. 1993. Vol. 91. P. 2275—2280.

Morris G. E., Simmons C, Man N. T. Apo-dystrophins (Dpi40 and Dp71) and dystrophin splicing isoforms in developing brain// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. Vol. 215 (1). P. 361—367.

Mostacciuolo M. L, Schiavon R, Angelini C. et al. Frequency of duplication at 17p11.2 in families of northest Italy with Charcot-Marie-

Tooth disease type Ml Neuroepidemiology. 1995. Vol. 14. P. 49—53. Mulley J. C, Kozman H. M., Phillips H. A. et al. Refined genetic localization for central core desease//Am. J. Hum. Genet. 1993. Vol. 52, P. 398—405.

Muntoni R, Melis M. A., Ganau A., Dubowitz V. Transcription of the dystrophin gene in normal tissues and in skeletal muscle of a family with X-linked dilated cardiomyopathy//Am. J. Hum. Genet. 1995a. Vol. 56. P. 151—157.

Muntoni R, Wilson L, Marrosu G. et al. A mutation in the dystrophin gene selectively affecting dystrophin expression in the heart// J. Clin. Invest. 1995b. Vol. 96. P. 693—699.

Murray J. C, Davies К. E., Harper P. S. et al. Linkage relationship of a cloned DNA sequence on the short arm of the X chromosome to Duchenne muscular dystrophy// Nature. 1982. Vol. 300. P. 69—71.

Nelis E.f Warner L. E., De Vriendt E. et al. Comparision of single-strand conformation polymorphism and heteroduplex analysis for detection of mutations in Charcot-Marie-Tooth type 1 disease and related neuropathies// Eur. J. Hum. Genet. 1996. Vol. 4. P. 329—333.

Nicholson G. A., Mesterovic N., Ross D. A. et al. Linkage of the gene for Charcot-Marie-Tooth neuropathy// (Abstr.) Cytogenet. Cell Genet. 1989. Vol. 51. P. 1052—1053.

Nidholson G. A., Dawkins J. L.t Blair LP. et al. The gene for hereditary sensory neuropathy typel (HSN-1) maps to chromosome 9q22.1q22.3// Nature Genet. 1996. Vol. 13. P. 101—104.

Nigro V., Piluso G., Belsito A. et al. Identification of a novel sarcoglycan gene at 5q33 encoding a sarcolemmal 35 kDa glycoprotein// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1179—1186.

Nigro V., Moreira E. S., Piluso G. Autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophy, LGMD2F, is caused by a mutation in the deltasarcoglycan gene// Nature Genet. 1996, Vol. 14. P. 195—198.

Nissenen M., Helbling-Leclerc A., Zhang X. et al. Substitution of a conserved cystein-996 in a cystein-rich motif of the laminin alpha2chain in congential muscular dystrophy with partial deficiency of the protein//Am. J. Hum. Genet. 1996. Vol. 58. P. 1177—1184.

Noguchi S., McNally E. M., Ben Othmane K. et al. Mutations in the dystrophin-associated protein gamma-sarcoglican in chromosome 13 muscular dystrophy// Science. 1995. Vol. 270. P. 819—822.

North K. N., Yang N., Wattanasirichaigoon D. et al. A common nonsense mutation results in a-actinin-3 deficiency in the general population// Nature Genet. 1999. Vol. 21. P. 353—354.

Nowak K. J., Wattanasirichaigoon D., Goebel H. H. et al. Mutations in the skeletal muscle a-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy// Nature Genet. 1999. Vol. 23. P. 208— 212.

Nudel U., Zuk D., Einat P. et al. Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain// Nature. 1989. Vol. 337. P. 76—78.

Olson Т. M., Michels V. V., Thibodeau S. N. et al. Actin mutations in delated cardiomyopathy, a heritable form of heartfailure// Science. 1998. Vol. 280. P. 750—752.

Often A. D., Tapscott S. J. Triplet repeat expansion in myotonic dystrophy alters the adjacent chromatin structure// Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. Vol. 92. P. 5465—5469.

Palau F., Lofgren A., De Jonghe P. et al. Origin of the de novo duplication in Charcot-Marie-Tooth disease type IA: unequal nonsisterchromatid exchange during spermatogenesis// Hum. Molec. Genet. 1993. Vol. 2. P. 2031—2036..

Pallavicini A., Zimbello R., Tiso N. et al. The preliminary transcript map of a human skeletal muscle// Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 1445—1450.

Papadopoulou L. C, Sue С. M., Davidson M. M. et al. Fatal infantile cardioencephalomyopathy with COX deficiency and mutations in SC02, a COX assemble gene// Nature Genet. 1999. Vol. 23. P. 333—337.

Parsons D. W.f McAndrew P. E., Monani U. R. An 11 base pair duplication in exon 6 of the SMN gene products a type I spinal muscular atrophy (SMA) phenotype: further evidence for SMN as the primary SMAdetermining gene// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1727—1732.

Passarge E. Col<5r atlas of genetics// N.-Y. Georg Thieme Verlag Stuttgart. 1995.411 p.

Passos-Bueno M.R., Bakker E., Kneppers A. L. J. et al. Different mosaicism frequencies for proximal and distal Duchenne muscular dystrophy (DMD) mutations indicate difference in etiology and recurrence risk//Am. J. Hum. Genet. 1992. Vol. 51. P. 1150—1155.

Passos-Bueno M. R., Moreira E. S., Roberds S. et al. A common missense mutations in the adhalin gene in three unrelated Brazilian

families with a relatively mild form of autosomal recessive limbgirdle muscular dystrophy//Hum. Mol. Genet. 1995. Vol. 4. P. 1163— 1167.

Passos-Bueno M. R., Moreira E. S., Marie S. K. et al. Main clinical features for the three mapped autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophy and estimated proportion of each form in 13 Brazilian families// J. Med. Genet. 1996a. Vol. 33. P. 97—102.

Passos-Bueno M. R., Moreira E. S., Vainzof M. et al. Linkage analysis in autosomal recessive limb girdle muscular dystrophy (AR LGMD) maps a sixth form to 5q33-34 (LGMD2F) and Indicates that there is at least one more subtype of AR LGMD// Hum. Mol. Genet. 1996b. Vol. 5. P. 815—821.

Patel P.I., Franco В., Garcia C. et al. Genetic mapping of autosomal dominant Charcot-Marie-Tooth disease in a large French-Acadian kindred: identification of new linked markers on chromosome 17// Am. J. Hum. Genet. 1990. Vol. 46. P. 801—809.

Patel P. I., Franco В., Cook J. et al. Construction of a physical map on mouse and human chromosome I: comparison of 13 Mb of mouse

and 11 Mb of human DNA//Hum. Mol. Genet. 1992. Vol.1. P. 613— 620.

Patel P. I., Roa В. В., Welcher A. A. et al. The gene for the peripheral myelin protein PMP-22 is a candidate for Charcot-Marie-Tooth disease type \NI Nature Genet. 1992a. Vol. 1. P. 159—165.

Pelin K., Hilpela P., Donner K. et al. Mutation in the nebulin gene associated with autosomal recessive nemaline myopathy// Proc. Nat. Acad Sci. 1999. Vol. 96. P. 2305—2310.

Peng H. В., Xie H., Rossi S. G., Rotundo R. L. Acetylcholinesterase clustering at the neuromuscular junction involves perlecan and dystroglycan//J. Cell Biol. 1999. Vol. 145. P. 911—921.

Pentao L, Wise C. A., Chinault A. C, Patel P. I., Lupski J. R. CharcotMarie-Tooth type IA duplication appears to arise from recombination at repear sequences flanking the 1.5 Mb monomer unit// Nature Genet. 1992. Vol. 2. P. 292—300.

Perrine S., Ginder G. D., Faller D. V. et al. A short-term trial of butyrate to stimulate fetal-globin-gene expression in the beta-globin disorders// New Engl. J. Med. 1993. Vol. 328. P. 81—86.

Piccolo F, Jeanpierre M., Leturcq F. et al. A founder mutation in the gamma-sarcoglycan gene of Gypsies possibly predating their migration out of India// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 2019— 2022.

Pham Y. C. N., thi Man N., Lam L. T, Morris G. E. Localization of myotonic dystrophy protein kinase in human and rabbit tissues using a new panel of monoclonal antibodies// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 1957—1965.

Phillips W. D., Noakes P. G., Roberds S. L, Campbell K. P., Merlie J. P.

Clustering and immobilization of acetylcholine receptors by the 43kD protein: a possible role for dystrophin-related protein// J. Cell Biol. 1993. Vol. 123. P. 729—740.

Piccolo F, Roberds S. L., Jeanpierre M. et al. Primary adhalinopathy: a common cause of autosomal recessive muscular dystrophy of variable severity// Nature Genet. 1995. Vol. 10. P. 243—245.

Pillers D.-A., Bulman D. E., Weleber R. G. et al. Dystrophin exprexion in the human retina is required for normal function as defined by electroretinography// Nature Genet. 1993. Vol. 4. P. 82—86.

 

Pizzuti A., Pieretti M., Fenwick R. G., Gibbs R. A., Caskey СТ. A transposon-like element in the deletion-prone region of the dystrophin gene// Genomics. 1992. Vol. 13. P. 594—600.

Plassart Т., Elbaz A., Santos J. V. et al. Genetic heteroheneity in hypokalemic periodic paralysis (hypoPP)// Hum. Genet. 1994. Vol. 94. P. 551—556.

Poulton J., Deadman M. E., Gardiner R. M. et al. Duplications of mitochondrial DNA in myopathy//Lancet. 1988. Vol. I. P. 236—240.

Poulton J., Morten K. J., Weber K. et al. Are duplication of mitochondrial DNA characteristic of Kearns-Sayre syndrome// Hum. Mol. Genet. 1994. Vol.3. P. 947—951.

Pramatarova A., Figlewicz D. A., Krizus A. et al. Identification of new mutations in the Cu/Zn superoxide dismutase gene of patients with familial amyotrophic lateral sclerosis//Am. J. Hum. Genet. 1995. Vol. 56. P. 592—596.

Ptacek L. J., Tyler F, Trimmer J. S., Agnew W. S., Leppert M. Analysis in a large hyperkalemic periodic paralysis pedigree support tight linkage to a sodium channel locus//Am. J. Hum. Genet. 1991. Vol. 49. P. 378—382.

Ptacek L. J., George A. L., Barchi R. L. et al. Mutations in an S4 segment in the adult skeletal muscle sodium channel cause paramyotonia congenita// Neuron. 1992. Vol. 8. P. 891—897.

Ptacek L. J., Tawil R., Griggs R. C. et al. Dihydropyridine receptor mutations cause hypokalemic periodic paralysis// Cell. 1994. Vol. 77. P. 863—868.

Pulkkinen L.f Smith F. J. D., Shimizu H. et al. Homozygous deletion mutations in the plectin gene (PLEC1) in patients with epidermolysis bullosa simplex associated with late-onset muscular dystrophy// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1539—1546.

Quane K. A., Healy J. M. S., Keating К. E. et al. Mutations in the ryanodine receptor gene in central core desease and malignant hyperthermia// Nature Genet. 1993. Vol. 5. P. 51—55.

Oudet C.f Hanauer A., Clemens P., Caskey Th., Mandel J.-L. Two hot spots of recombination in the DMD gene correlate with the deletion prone regions// Hum. Mol. Genet. 1992. Vol. 1 (8). P. 599—603.

Rafael J. A., Tinsley J. M., Potter A. C, Deconinck A. E., Davies К. E.

Skeletal muscle-specific expression of a utrophin transgene rescues utrophin-dystrophin deficient mice// Nature Genet. 1998. Vol. 19. P. 79—82.

Reaume A. G., Elliott J. L, Hoffman E. K. et al. Motor neurons in Cu/Zn superoxide dismutase-deficient mice develop normally but exhibit enhanced cell death after axonal injury// Nature Genet. 1996. Vol. 13. P. 43—47.

Reddy S., Smith D. B. J., Rich M.M. et al. Mice lacking the myotonic dystrophy protein kinase develop a late onset progressive myopathy// Nature Genet. 1996. Vol. 13. P. 325—335.

Richard I., Broux O., Allamand V. et al. Mutations in the proteolytic enzime calpain 3 cause limb-girdle muscular dystrophy type 2NI Cell. 1995. Vol. 81. P. 27—40.

Ripps M. E., Huntley G. W., Hof R. P., Morrison J. H., Gordon J. W.

Transgenic mice expressing an altered murine superoxide dismutase gene provide an animal model of amyotrophic lateral sclerosis// Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. Vol. 92. P. 689—693.

Roa В. В., Garcia C. A., Pentao L. et al. Evidence for a recessive PMP22 point mutation in Charcot-Marie-Tooth disease type \NI Nature Genet. 1993a. Vol. 5. P. 189—194.

Roa В. В., Dyck P. J., Marks H. G., Chance P. F., Lupski J. R. DejerineSottas syndrome associated with point mutation in the peripheral myelinprotein 22 (PMP22) gene// Nature Genet. 1993b. Vol. 5. P. 269—273.

Roberds S. L, Leturcq F, Allamand V. et al. Missense mutations in the adhalin gene linked to autosomal recessive muscular dystrophy// Cell. 1994. Vol. 78. P. 625—633.

Roberts R. G., Bentley D. R.f Barby T. F. M., Manners E., Bobrow M.

Direct diagnosis of carriers of Duchenne and Becker muscular dystrophy by amplification of lymphocyte RNA// Lancet. 1990. Vol. 336. P. 1523—1526.

Roberts R. G., Bobrov M., Bentley D. R. Point mutation in the dystrophin gene// Proc. Natl. Acad. Sci. 1992a. Vol. 89. P. 2331—2335.

Roberts R. G., Passos-Bueno M. R., Bobrov M., Vainzof M., Zatz M. Point mutation in a Becker muscular dystrophy patient// Hum. Mol. Genet. 1992b. Vol. 2. P. 75—77.

Roberts R. G., Coffey A. G., Bobrow M., Bentley D. R. Determination of the exon structure of the distal portion of the dystrophine gene by vectorette PCR//Genomics. 1992c. Vol. 13. P. 942—950.

Roberts R. G., Coffey A. G., Bobrow M., Bentley, D. R. Exon structure of the human dystrophine gene//Genomics. 1993. Vol. 16. R 1—3.

Roberts R. G., Freeman Т. C, Kendall E. et al. Characterization of DPR2, a novel human dystrrophin homologue// Nature Genet. 1996. Vol. 13. P. 223—226.

Roberts R. G.f Bobrow M. Dystrophins m vertebrates and invertebrates//Hum. Mol. Genet. 1998. Vol.7. P. 589—595.

Rodrigues N. R., Owen N.. Talbot K. et al. Gene deletion in spinal muscular atrophy//J. Med. Genet. 1996. Vol. 33. P. 93—96.

Rothstein J. D., Martin L. J., Kuncel R. W. Decreased glutamate transport by the brain and spinal cord in amyotrophic lateral sclerosis// New Engl. J. Med. 1992. Vol. 326. P. 1381—1384.

Roy N.f Mahadevan M. S.f McLeon M. et al. The gene for neuronal apoptosis inhibitory protein is partially deleted in individuals with spinal muscular atrophy//Cell. 1995. Vol. 80. P. 167—178.

Rudolph J. A., Spier S. J., Byrns G. et al. Periodic paralysis in Quarter horses: a sodium channel mutation dessemeneited by selective breeding Nature Genet. 1992. Vol. 2. P. 144—147.

Sabina R. L, Morisaki Т., Clarke P. et al. Characterization of the human and rat myoadenylat deaminase genes// J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. P. 9423—9433.

Sadoulet-Puccio H. M., KhuranaT. S., Cohen J. В., Kunkel L. M. Clonning and characterization of the human homologue of the dystrophinrelated phosphoprotein found at the Torpedo electric organ postsynaptic membrane// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5 P. 489—496. Sarfarazi M., Wijmenga C, Upadhyayava M. et al. Regional mapping of facioscapulohumeral muscular dystrophy gene on 4q35: combined analysis an international consortium//Am. J. Hum. Genet. 1992. Vol. 51. P. 396—403.

Scharf J. M.f Endrizzi M. G., Wetter A. Identification of a candidate modifiying gene for spinal muscular atrophy by comparative genomics// Nature Genet. 1998. Vol. 20. P. 83—86.

Schneider C, King R. M., Philipson L. Genes specificallyy expressed at growth arest of mammalian cells// Cell. 1988. Vol. 54. P. 787—793.

Schoffner J. M., Wallace D. C. Oxidative phosphorilation diseases// In: ScriverC. R., BeaudetA. L, Sly W. S., Valle D. (eds).The Metabolic

and Molecular Bases of Inherited Disease. 1995. McGraw-Hill.N.Y. Vol. 1. P. 1535—1609.

Schwartz M., Sorensen N., Hansen F. J. et al. Quantification, by solidphase minisequencing, of the telomeric and centromeric copies of the survival motor neuron gene in families with spinal muscular atrophy// Hum. Mol. Genet. 1997. Vol .6. P. 99—104.

Sealock R., Froehner S. C. Dystrophin-associated proteins and synapse formation: is a-dystroglycan the agrin receptor?// Cell. 1994. Vol. 77. P. 617—619.

Sewry C. A., Sansome A., Matsumura K., Campbell K. P., Dubowitz V.

Deficiency of the 50 kDa dystrophin-associated glycoprotein and abnormal expression of utrophin in two South Asian cousins with variable expression of severe childhood autosomal recessive muscular dystrophy// Neuromusc. Disord. 1994. Vol. 4. P. 121— 129.

Shaw D. A., McCurach M. E., Rundle S. A. et al. Genomic organization and transcriptional units at the myotonic dystrophy locus// Genomics. 1993. Vol. 18. P. 673—679.

Shanske S., Sakoda S., Hermodson M.A., DiMauro S., Schon E. A.

Isolation of a cDNA encoding the muscle-specific subunit of human phosphoglycerate mutase// J. Biol. Chem. 1987 Vol. 262. P. 14612—14617.

Shoubridge E. A., Johns Т., KarpatM G. Complete restoration of a wild-type mtDNA genotype in regenerating muscle fibres in a patient with a tRNA point mutation and mitochondrial encephalomyopathy// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 2239—2242.

Siddique Т., Pericak-Vance M. A., Brooks B. R. et al. Genetic linkage analysis in familial amyotrophic lateral sclerosis// (Abstr.) Cytogenet. Cell Genet. 1989. Vol. 51. P. 1080 only.

Siddique Т., Figlewicz D. A., Pericak-Vance M. A. et al. Linkage of a gene causing familial amyotrophic lateral sclerosis to chromosome 21 and evidence of geneticlocus heterogeneity// New Engl. J. Med. 1991. Vol. 324. P. 1381—1384.

Siddique Т., Deng H-X. Genetics of amiotrophic lateral sclerosis// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1465—1470.

Skre H. Genetic and clinical aspects of Charcot-Marie-Tooth’s disease// Clin.Genet. 1974. Vol. 6. P. 98—118.

Slipetz D. M., Aprille J. R., Goodyer R R., Rozen R. Deficiency of complex III of the mitochondrial respiratory chain in a patient with facioscapulohumeral desease//Am. J. Hum. Genet. 1991. Vol. 48. P. 502—510.

Small K., Iber J., Warren S. T. Emerin deletion reveals a common Xchromosome inversion mediated by inverted repeats// Nature Genet. 1997. Vol. 16. P. 96—99.

Small K., Warren S. T. Emerin deletions occurring on both Xq28 inversion backgrounds// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 135 139.

Smith F. J. D., Eady R. A. J., Leigh I. M. et al. Plectin deficiency results in muscular dystrophy with epidermolysis bullosa// Nature Genet.

1996. Vol. 13. P. 450—457.

Sosinsky G. Mixing of connexins in gap junction membrane channels.// Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. Vol. 92. P. 9210—9214.

Speer M. C, Tandan R., Rao P. N. et al. Evidence for locus heterogeneity in the Bethlem myopathy and linkage to 2q37// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol.5. P. 1043—1046.

Steinmeyer K., Ortland C, Jentsch T. J. Primary structure and functional expreddion of a developmental^ regulated skeletal muscle chloride channel// Nature. 1991a. P. Vol. 354. P. 301—304.

Steinmeyer K., Klocke R., Ortland C. et al. Inactivation of muscle chloride channel by transposon insertion in myotonic mice//Nature. 1991b. Vol. 354. P. 304—308.

Sternberg D., Dananl O, Lombns A. et al. Exhaustive scanning approach to screen all the mitochondrial tRNA genes for mutations and its application to the investigation of 35 independent patients with mitochondrial disorders// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 33— 42.

Su Y., Brooks D. G., Li L. et al. Myelin protein zero gene mutated in Charcot-Marie-Tooth type IB patients// Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. Vol. 90. P. 10856—10860.

Suomalainen A., Majander A., Haltia M. et al. Multiple deletions of mitochondrial DNA in several tissues of the patient with severe retarded depression and familial progressive external ophthalmoplegia//J. Clin. Invest. 1992. Vol .90. P. 61—66.

Suter U., Moskow J. J., Welcher A. A. A leucine-to-proline mutation in the putative first transmembrane domain of the 22 kDa peripheral myelin protein in the trember-J mouse// Proc. Natl. Acad. Sci. 1992. Vol .89. P. 4382—4386.

Suzuki A., Yoshida M., Hayashi K., Mizuno Y, Hagiwara Y, Ozawa E. Molecular organization at the glycoprotein-complex-binding site of dystrophin. Three dystrophin-associated proteins bind directly to the carboxy-terminal portion of dystrophin// Eur. J. Biochem. 1994. Vol. 220. P. 283—292.

Suzuki A., Yoshida M., Ozawa E. Mammalian alphaland betal-syntrophin bind to the alternative splice-prone region of the dystrophin COOH

terminus//J. Cell Biol. 1995. Vol. 128. P. 373—381.

Tahvanainen E., Beggs A. H., Wallgren-Pettersson C. Exclusion of two candidate loci for autosomal recessive nemaline myopathy//J. Med. Genet. 1994. Vol. 31. P. 79—80.

Takeshima H.f lino M., Takekura H. et al. Exitation-contraction uncoupling and muscular degeneration in mice lacking functional skeletal muscle ryanodine receptor gene// Nature. 1994. Vol. 369. P. 556— 559.

Talbot K., Ponting C. P., Theodosiou A. M. et al. Missense mutation clustering in the survival motor neuron gene: a role for conserved tyrosine and glycine rich region of the protein in RNA metabolism?// Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6. P. 497—500.

Talbot K., Miguel-Aliaga I., Mohaghegh P. et al. Characterization of a gene encoding Survival Motor Neuron (SMN)-related protein, a constituent of the spliceosome complex// Hum. Mol. Genet. 1998. Vol.7. P. 2149—2156.

Tan P. et al. Homozygosity for a nonsense mutation in the a-tropomiosine gene ТРМЗ in a patient with severe nemaline myopathy// Neuromuscul. Disord. 1999. Vol. 7.427—428.

Taneja K. L, McCurrach M., Schalling M., Housman D., Singer R. H.

Foci of trinucleotide repeat transcripts in nuckei of myotonic dystrophy cells and tissue// J. Cell Biol. 1995. Vol. 128. P. 995— 1002.

Taroni F, Verderio E., Fiorucci S. et al. Molecular characterization of inherited carnitine palmitoyltransferase II deficiency// Proc. Natl. Acad. Sci. 1992. Vo. 89. P. 8429—8433.

Taroni F, Verderio E., Dworzak F. et al. Identification of the common mutation in the carnitine palmitoyltransferase II gene in familial recurrent myoglobinuria patients// Nature Genet. 1993. Vol. 4. P. 314—320.

Tawil R., Storwick D., Weiffenbach B. et al. Chromosome 4q rearragement in monozygotic twins discordant for facioscapulohumeral muscular dystrophy//Hum. Mutat. 1993. Vol. 2. P. 492—494.

Tennyson C. N., Klamut H. J., Worton R. G. The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is ^transcriptionally spliced// Nature Genet. 1995. Vol. 9. P. 184—190.

Tennyson C. N.. Dally G. Y, Ray P. N., Worton R. G. Expression of the dystrophin isoform Dp71 in differentiating human fetal myogenic cultures//Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1559—1566.

Thomas N. S. T, Williams H.f Elsas L. J. et al. Localisation of the gene for Emery-Dreifuss muscular dystrophy to the distal long arm of the X chromosome// J. Med. Genet. 1986. Vol. 23. P. 596—598.

Thomas N. S. Т., Sarfarazi M., Roberts K. et al. X-linked myotubular myopathy (MTM1): evidence for linkage to Xq28 DNA markers// (Abstract) Cytogenet. Cell Genet. 1987. Vol. 46. P. 704 only.

Thomas N.S.T., Williams H.f Cole G. et al. X-linked neonatal centronuclear/ myotubular myopathy: evidence for linkage to Xq28 DNA marker loci//J. Med. Genet. 1990. Vol. 27. P. 284—287.

Thompson T. G.f DiDonato C. J., Simard R. L. et al. Anovel cDNAdetects homozygous microdeletions in greater than 50% of type I spinal muscular atrophy patients// Nature Genet. 1995. Vol. 9. P. 5662.

Timchenko L. T, Nastainczyk W., Schneider T. etal. Full-length myotoninprotein kinase (72 kDa) displays serine kinase activity// Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. Vol. 92. P. 5366—5370.

Timchenko L. Т., Timchenko N. A., Caskey С. T, Roberts R. Novel proteins with binding specificity for DNA CTG repeats and RNA CUG repeats: implications for myotonic dystrophy// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 115—121.

Timmerman V, Raeymaekers P., De Jonghe P. et al. Assignment of the Charcot-Marie-Tooth neuropathy type I (CMT1 a) gene to 17p11.2p12//Am. J. Hum. Genet. 1990. Vol. 47. P. 680—685.

Timmerman V, Nelis E., Van Hul W. et al. The peripheral myelin protein gene PMP-22 is conteined within the Charcot-Marie-Tooth disease type IA duplication// Nature Genet. 1992. Vol. 1. P. 171—175.

Timmerman V.f De Jonghe P., Simokovic S. et al. Distal hereditary motor neuropathy type II (distal HMNII): mapping of a locus to chromosome 12q24// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1065—1069.

Tinsley J. M.f Blake D. J., Davies К. E. Apo-dystrophin-3: a 2.2-kb transcript from the DMD locus encoding the dystrophin glycoprotein binding site// Hum. Molec. Genet. 1993. Vol. 2. P. 521—524.

Tinsley J. M., Davies К. E. Utrophin: a potential replacement for dystrophin?// Neuromusc. Disord. 1993. Vol. 3 (5/6). P. 537—539. Tinsley J. M., et al. Amelioration of the dystrophic phenotype of mdx mice using a truncated utrophin transgene// Nature. 1996. Vol. 384. P. 349—352.

TodaT, Kanazawa I., Nakamura J. Localization of the gene responsible for Fukujama type congenital muscular dystrophy to chromosome

9q31 -33 by linkage analysis// (Abstract). Human Genome Mapping Workshop 93.1993. P. 20 only.

Toda T, Yoshioka M.f Nakahori Y. et al. Genetic identity of Fukujama type congenital muscular dystrophy and Walker-Warburg syndrome//Ann. Neurol. 1995. Vol. 37. P. 99—101.

Toda T, Miyake M.f Kobayashi K. et al. Likage disequilibrium mapping narrows the Fukujama type congenital muscular dystrophy (FCMD) candidate region to less than 100 kb//Am. J. Hum. Genet. 1996. Vol.59. P. 1313—1320.

Towbin J. A., Hejtmanicik F, Brink P. et al. X-linked cardiomyopathy

(XLCM): molecular genetic evidence of linkage to>the Duchenne muscular dystrophy (dystrophin) gene at the Xp21 locus// Circulation. 1993. Vol. 87. P. 1854—1865.

Towbin J. A. The role of cytoskeletal proteins in cardiomyopathies// Curr. Opin. Cell Biol. 1998. Vol. 10. P. 131—139.

Tsujino S., Shanske S., DiMauro S. Molecular genetic heterogeneity of myophosphorylase deficiency (McArdle’s disease)// New Eng. J. Med. 1993a. Vol. 329. P. 241—245.

Tsujino S., Shanske S., Sakoda S., Fenichel G., DiMauro S. The molecular genetic basis of muscle phosphoglycerate mutase (PGAM) deficiency//Am. J. Hum. Genet. 1993b. Vol. 52. P. 472— 477.

Tsujino S., Shanske S., DiMauro S. Two novel mutations (E654K, L396P) in Caucasian patients with myophosphorylase deficiency (McArdle’s disease)// Hum. Mutat. 1995. Vol. 6. P. 276—277.

Udd В., Rapola J., Nokelainen R, Aricawa E., Somer H. Nonvacuolar myopathy in a large family with both late adult onset distal myopathy

and sever proximal muscular dystrophy// J. Neurol. Sci. 1992. Vol. 113. P. 214—221.

Upadhyayava M., Lunt P. W., Sarfarazi M. et al. A closely linked DNA marker for facioscapulohumeral desease on chromosome 4q// J. Med. Genet. 1991. Vol. 28. P. 665—671.

Vainzof M.f Passos-Bueno M. R., Canovas M. et al. The sarcoglycan complex in the six autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophy// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 1963—1969.

Valentijn L. J., Bolhuis P. A., Zorn I. et al. The peripheral myelin gene

PMP-22/GAS-3 is duplicated in Charcot-Marie-Tooth disease type IA// Nature Genet. 1992a. Vol. 1. P. 166—170.

Valentijn L. J.f Baas R, Wolterman R. A. et al. Identical point muations of PMP-22 in Trembler-J mouse and Charcot-Marie-Tooth disease type IA// Nature Genet. 1992b. Vol. 2. P. 288—291.

Valenzuela D. M., Stitt T. N., DiStefano P. S. et al. Receptor tyrosine kinase specific for the skeletal muscle lineage: expression in embryonic muscle, at the neuromuscular junction, and after injury// Neuron. 1995. Vol. 15. P. 573—584.

Vance J. M. Hereditary motor and sensory neuropathies//J. Med. Genet. 1991. Vol. 28. P. 1—5.

van der Kooi A. J., et al. Genetic Localization of a newly recognized autosomal dominant limb-girdle muscular dystrophy with cardiac involvement (LGMD1B) to chromosome 1q11-21//Am. J. Hum. Genet. 1997. Vol. 60. P. 891—895.

van der Steege G., Draaijers T. G., Grootscholten P. M. et al. A provisional transcript map of the spinal muscular atrophy (SMA) critical region// Eur. J. Hum. Genet. 1995a. Vol. 345. P. 985—986. van der Steege G., Grootscholten P. M., van der Vlies P. et al. PCRbased DNA test to confirm clinical diagnosis of autosomal recessive spinal muscular atrophy//Lancet. 1995b. Vol. 345. P. 985—986. van Deutekom J. С. Т., Bakker E., Lemmers R. J. L. F. et al. Identification of the first gene (RRG1) from the FSHD region human chromosome 4q35// Hum. Mol. Genet. 1996a. Vol. 5. P. 581—590.

van Deutekom J. С. Т., Bakker E., Lemmers R. J. L. F. et al. Evidence for subtelomeric exchange of 3.3 kb tandem repeat units between chromosomes 4q35 and 10q 26: implications for genetic counselling

and etiology of FSHD1//Hum. Mol. Genet. 1996b. Vol. 5. P. 1997— 2003.

Velasco E., Valero C, Valero A., Moreno F., Hernandes-Chico C.

Molecular analysis of the SMN and NAIP genes in Spanish spinal muscular atrophy families and correlation between number of copies of CBCD541 and SMA phenotype// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 257—263.

Vicart P., Dupret J.-M., Huzan J. et al. Human desmin gene: cDNA sequence, regional localization and exclusion of the locus in a familial desmin-related myopathy// Hum. Genet. 1996. Vol. 98. P. 422— 429.

Vicart P., Caron A., Guicheney P. et al. A missence mutation in the alphaBcrystallin chaperone gene cause a desmin-related myopathy// Nature Genet. 1998. Vol. 20. P. 92—95.

Viegas-Pequignot E., Lin L. Z., Dutrilaux B. et al. Assignment of human desmin gene to band 2q35 by nonradioactive in situ hybridization// Hum. Genet. 1989. Vol. 83. P. 33—36.

Vuolteenaho R., Nissenen M., Sainio K. et al. Human laminin M chain

(merosin): complete primary structure, chromosomal assignment and expression of the M and A chain in human fetal tissues// J. Cell Biol. 1994. Vol. 124. P. 381—394.

Wallace D. C, Lott M. Т., Brown M. D. et al. Report of the committe on human mitochondrial DNA// In: Cuticchia A. J. (ed.). Human Gene Mapping 1995: A Compendium.-1995.JohnHopkins Univ. Press. Baltimore. P. 910—954.

Wallgren-Petersson C, Arjomaa P., Holmberg C. Alfa-actinin and myosin light chains in congenetal nemaline myopathy// Pediat. Neurol. 1990. Vol.6. P. 171—174.

Wang С. H., Xu J., Carter T. A. et al. Characterization of survival motor neuron (SMNt) gene in asymptomatic carriers of spinal muscular atrophy// Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5. P. 359—365.

Wang J., Rojas С. V., Zhou J. et al. Sequence and genomic structure of the human adult skeletal muscle sodium channel alpha-subunit gene on 17q//Biochem. Biophys Res. Commun. 1992. Vol. 182. P. 794— 801.

Wang J., Pansky A., Venuti J. M. et al. A sea urchin gene encoding dystrophin-related proteins//Hum. Mol. Genet. 1998. Vol. 7. P. 581— 588.

Wang К., Knipfer M., Huang Q.-Q. et al. Human skeletal muscle nebulin sequence encodes a blueprint for thin filament architekt