CRISPR-Cas9 — эффективный, но не универсальный инструмент генотерапии.
Генная терапия возникла в 1990-х годах и за свою короткую историю достигла многого: на данный момент в клиническую практику уже внедрены генотерапевтические препараты, облегчающие симптомы тяжелых наследственных болезней, включая спинальную мышечную атрофию и дегенерацию сетчатки.
Классическая генотерапия заключается в доставке копии здорового гена в целевые клетки. Доставка осуществляется с помощью векторов, которыми чаще всего выступают вирусы, обладающие природной способностью внедряться в клетки хозяина. Система CRISPR-Cas9 работает по-другому: она находит определенный участок ДНК и разрезает его, блокируя работу дефектного гена — «виновника» заболевания. В основе этого механизма лежит способность бактерий обороняться от атакующих их бактериофагов.
Система CRISPR-Cas, отвечающая за адаптивный иммунитет, есть почти у половины известных бактерий. CRISPR — одинаковые повторяющиеся последовательности, в которых бактерия хранит «фотокарточки» убитых ею патогенов. Благодаря такому «фотоальбому» при будущих встречах с бактериофагами она быстро их распознает и уничтожает. Помогают ей в этом специальные белки Cas, в том числе и Cas9.
Сегодня система CRISPR-Cas9 — один из наиболее востребованных инструментов генной терапии. Генетические ножницы могут воздействовать на геном клеток ex vivo и in vivo. В первом случае осуществляется забор нужных клеток, в лаборатории их геном редактируется с помощью CRISPR-Cas9, после чего они вводятся обратно в организм. Во втором генетические ножницы транспортируются к целевым клеткам с помощью вирусных и невирусных векторов.
Кроме CRISPR-Cas9, ученые проявляют интерес и к другим системам. Например, CRISPR-Cas13a широко применяется в молекулярной диагностике.
Анча Баранова, доктор биологических наук, профессор:
Зачастую генетические ножницы называют новой технологией, которая пришла на смену старенькой классической генотерапии. Однако генотерапия никуда не делась, и генетические ножницы — лишь ее разновидность. Потому что всё равно клетки модифицируются, только не с помощью вставления генов, а путем их вырезания. Возможности CRISPR-Cas9 позволяют и исправлять гены. Можно даже делать небольшие вставки в геном, заменяя одну копию гена на другую. Но пока эти инструменты CRISPR-Cas находятся «в загашнике», и на практике генетические ножницы применяются для вырезания генов.
Хотя может показаться, что вырезание безопаснее вставления, так как ничего нового не добавляется, на самом деле это не так. Риск развития осложнений после применения генотерапии и CRISPR-Cas9 примерно одинаковый: всегда существует вероятность, что генетические ножницы вырежут что-то не там и уберут «нужное».
Генетические ножницы — не универсальный инструмент. Есть заболевания, когда применение CRISPR-Cas9 нецелесообразно. Но для лечения некоторых болезней эта технология эффективна и наиболее разумна. Всё зависит от типа мутации. Например, есть такое тяжелое заболевание, как дистрофия Дюшенна, приводящая к быстро прогрессирующей мышечной слабости. Часто она возникает из-за делеций в гене, кодирующим дистрофин — белок, играющий важную роль в функционировании мышц.
Делеция — исчезновение части гена. И если часть гена отсутствует, исправить этот дефект генетическими ножницами невозможно. Единственный способ починить его — классическая генотерапия: внедрение в клетки здорового гена, кодирующего дистрофин.
Недавно был одобрен генотерапевтический метод лечения дистрофии Дюшенна, работающий по этому принципу — в клетки внедряется мини-ген, правда, не совсем стандартный, но это лучше, чем ничего. Ген, кодирующий дистрофин, — крупнейший у человека, его невозможно поместить в вирусный вектор и доставить в целевые клетки. Поэтому ученые пошли другим путем: они внедряют в клетки ген микродистрофина, что облегчает симптомы заболевания.
С другой стороны, существуют аутосомно-доминантные заболевания, при которых у больного есть две копии гена: одна — нормальная, а вторая — плохая. В этой второй копии содержится мутация, запускающая болезнь. И если плохую копию удалить, то оставшаяся справится с возложенной на ген функцией. При таких генетических дефектах применение CRISPR-Cas9 — очень хороший вариант.
К сожалению, на сегодняшний день ни CRISPR-Cas9, ни классическая генная терапия не способны полностью избавить человека от заболевания, обусловленного генетикой. Чтобы победить болезнь, нужно доставить здоровый ген либо CRISPR-Cas9 в каждую клетку. Однако у ученых таких способов пока нет.
Невозможность доставки генетического материала во все клетки организма — ключевая проблема генотерапии. И с появлением генетических ножниц она никуда не делась, так как CRISPR-Cas9 тоже требует доставки.
С помощью генной терапии можно изменить работу 10% или менее клеток организма, что смягчит симптомы заболевания. Например, если при гемофилии отредактировать геном гепатоцитов или доставить в них здоровый ген, кодирующий фактор свертывания крови, то болезнь не исчезнет полностью. До нормы уровень фактора свертывания крови в организме не восстановится, печень будет вырабатывать какой-то процент от нормы этого белка. Но это гораздо лучше, чем ничего. У человека с гемофилией кровь в принципе начнет сворачиваться, хоть и медленнее, чем в норме.
Применение CRISPR для лечения и диагностики заболеваний
1. Онкология
Перспективный метод лечения онкологии — адоптивная клеточная терапия, которая заключается в трансформации Т-клеток (Т-лимфоцитов) пациента в «разрушителей» раковых опухолей. В большинстве случаев эту трансформацию проводят ex vivo c помощью CRISPR-Cas9.
Во время редактирования в клетку вводится специальный сконструированный ген, который наделяет Т-лимфоцит способностью распознавать антигены злокачественных опухолей. Также в Т-клетках отключаются гены иммунологических контрольных точек.
В настоящее время ведется множество клинических испытаний адоптивной клеточной терапии CRISPR-Cas9: методика тестируется на пациентах с карциномой желудка, лимфомой Ходжкина, раком пищевода, легких, поджелудочной железы.
В 2020 году ученые Тель-Авивского университета разработали липидные наночастицы LNP для доставки генетических ножниц к целевым клеткам. Система нацелена на онкоген Plk1, подталкивающий опухоль к агрессивному росту. Для тестирования на животных ученые выбрали наиболее тяжелые онкозаболевания: глиобластому (агрессивную опухоль мозга) и метастатический рак яичников.
Однократная внутримозговая инъекция CRISPR-LNP запустила апоптоз злокачественных клеток, что подавило рост опухоли на 50% и повысило выживаемость мышей на 30%. Применение CRISPR-LNP при раке яичников увеличило выживаемость грызунов на 80%.
2. Хронический гепатит В
На животных моделях система CRISPR-Cas9 продемонстрировала эффективность при лечении заболеваний печени, включая хронический гепатит В. По оценкам ВОЗ, этим заболеванием страдает не менее 257 млн человек в мире. Без лечения оно приводит к циррозу и раку печени.
Вирус гепатита В — коварный и живучий патоген. После проникновения в ядро гепатоцита его ДНК трансформируется в особую стабильную структуру — ковалентно-замкнутую кольцевидную ДНК (cccDNA), которая служит промежуточным звеном в жизненном цикле вируса. Современные методы лечения не способны разрушить cccDNA, а лишь умеют подавлять ее активность. В связи с этим сегодня хронический гепатит В относится к неизлечимым болезням.
Уничтожение ДНК вируса оказалось по плечу CRISPR-Cas9. Китайские ученые упаковали ножницы в биометрические наночастицы и ввели их в организм мышей с индуцированным гепатитом В. После проникновения в пораженные гепатоциты генетические ножницы разрушили cccDNA вируса.
3. Серповидно-клеточная анемия и β-талассемия
К часто встречающимся моногенным генетическим заболеваниям относятся серповидно-клеточная анемия и β-талассемия. При этих болезнях изменяются свойства гемоглобина, что приводит к анемии, ишемии тканей, сильным болям, поражению жизненно важных органов. Основными причинами смертности и инвалидизации становятся инсульты, которые атакуют каждого пятого пациента в возрасте до 20 лет.
Для борьбы с заболеваниями можно использовать фетальный гемоглобин. В норме он перестает вырабатываться после рождения, потому что определенный белок блокирует его синтез. Ген, кодирующий этот белок, стал мишенью CRISPR-терапии.
Анча Баранова:
Фетальный гемоглобин в норме отключен, потому что это гемоглобин плода. Но так как у людей с серповидно-клеточной анемией и β-талассемией «взрослый» гемоглобин нефункциональный, у ученых возникла идея «вернуть» таким пациентам выработку фетального гемоглобина и тем самым снизить гипоксию тканей.
Конечно, он не такой эффективный, как нормальный гемоглобин. Но, опять же, это лучше, чем ничего. Происходит частичная компенсация потерянной функции, что облегчает течение заболевания. Ученые блокируют ген BCL11A, чтобы ослабить контроль за фетальным гемоглобином и вновь «разрешить» его выработку в организме.
В 2019 году ученым удалось блокировать BCL11A в гемопоэтических стволовых клетках (ГСК). Позже эту методику применили на людях: ГСК, отредактированные ex vivo с помощью генетических ножниц, трансплантировали двум пациентам с диагнозами серповидно-клеточная анемия и β-талассемия.
У обоих пациентов через год после лечения уровень фетального гемоглобина значительно повысился. Последующее испытание с участием восьми пациентов показало аналогичные результаты.
Проходят клинические испытания EDIT-301 — еще одного метода лечения серповидно-клеточной анемии. В этом случае клетки редактируют с помощью белка Cas12a, нацеленного на гены «взрослого» гемоглобина — HBG1 и HBG2. Этот белок обладает большей специфичностью и эффективностью по сравнению с Cas9.
В 2023 году стали известны результаты применения EDIT-301 для лечения четырех пациентов с серповидно-клеточной анемией. Через 4 месяца после инфузии отредактированных ГСК у всех пациентов наблюдался физиологический уровень общего гемоглобина. Лечение продемонстрировало безопасность и отсутствие явных побочных эффектов.
4. Вирус иммунодефицита человека
Стандартное лечение ВИЧ — антиретровирусная терапия (АРТ), которая заключается в регулярном приеме двух и более противовирусных препаратов. АРТ сдерживает прогрессирование ВИЧ, но не может разрушить геном вируса.
В 2020 году ученые попытались с помощью генетических ножниц уничтожить ДНК вируса в организме ВИЧ-положительных приматов — и оказалось, что эта стратегия работает.
В сентябре 2021 года FDA одобрило генотерапевтический препарат EBT-101 для лечения ВИЧ-инфекции у людей. Предполагается, что всего лишь одна инъекция препарата может избавить носителя ВИЧ от болезни. Генетические ножницы доставляются к целевым клеткам с помощью AAV-вектора, после чего делают два «разреза» в вирусе и удаляют большую часть его генома.
Препарат уже тестируется на девяти пациентах с ВИЧ. Через три месяца после введения EBT-101 испытуемым отменят антиретровирусную терапию, после чего они включатся в протокол длительного наблюдения. По предварительным данным, исследование завершится в марте 2025 года.
5. Амавроз Лебера
Проходят клинические испытания генотерапевтического препарата EDIT-101 для лечения врожденного амавроза Лебера 10-го типа — наследственного заболевания, приводящего к дегенерации сетчатки и слепоте. С помощью инъекции препарат вводится в глаз, после чего попадает в фоторецепторные клетки, отвечающие за светочувствительность.
У троих из 14 пролеченных пациентов значительно улучшилась острота зрения.
EDIT-101 хорошо переносился и не вызывал серьезных побочных эффектов.
6. COVID-19
CRISPR-системы используются не только для лечения, но и для новых методов диагностики. Вспышка COVID-19 еще раз доказала, что в условиях эпидемии требуются тесты, способные быстро и с высокой точностью находить нуклеиновые кислоты патогенов в разных образцах. Ранее учеными Массачусетского технологического института была разработана система SHERLOCK, в основе которой лежит технология CRISPR-Cas13a. Она быстро распознает РНК различных патогенов, однако диагностика состоит из множества сложных этапов.
Следующим поколением технологии стал метод STOP (тестирование в одном флаконе), который упрощает диагностику и повышает ее точность. Одна из его разновидностей предназначена для обнаружения коронавируса.
Чувствительность метода составляет 93,1%, специфичность — 98,5%, что делает его более точным инструментом, чем ПЦР. Система выдает результат за один час и подходит для использования в пунктах оказания медицинской помощи.
Ограничения CRISPR
За последние годы CRISPR-системы неоднократно продемонстрировали свою эффективность на практике, однако их применение пока ограничено, что в первую очередь связано с отсутствием безопасной, стабильной и эффективной стратегии доставки. Например, могут возникнуть непредсказуемые осложнения при доставке CRISPR в кардиомиоциты: в сердце сильный кровоток, что повышает вероятность попадания CRISPR в нецелевые ткани.
Решить проблему точной доставки можно с помощью детального изучения механизмов возникновения и прогрессирования той или иной болезни. Любое заболевание сопровождается избыточным синтезом тех или иных белков в клетках. Создание векторов из наноматериалов, специфически прилипающих именно к этим белкам, повысит точность доставки. Большой интерес ученые проявляют к материалу из самого организма — биопленке клеток.
Анча Баранова:
Основная причина ограниченного применения CRISPR-Cas9 — опасения ученых по поводу того, что генетические ножницы попадут в клетки зародышевой линии, и после у нас появится новое поколение отредактированных людей. Если вы запускаете ножницы в организм, они могут во всех частях тела работать. В связи с этим ученые стараются вводить их в органы, находящиеся за иммунологическим барьером, например, в глаз. Этот барьер между глазом и кровью просто «не выпустит» лечебную генетическую конструкцию за пределы органа.
Если говорить о генотерапии и клеточной терапии в целом, то очень долгое время у нас было искусственное сдерживание этих технологий. Однако в последние годы стало понятно, что дальше их «тормозить» невозможно. Главным «жандармом» геномных и клеточных технологий всегда были США, а точнее FDA, чья позиция примерно такая: вы докажите 100-процентную безопасность метода, и тогда, возможно, мы его одобрим.
Но абсолютную безопасность чего-либо доказать невозможно! В последние два года в FDA произошла регуляторная революция, и многое стало разрешено. В мире генной терапии наступил ренессанс!
Раньше люди в первую очередь стремились к прогрессу, а не к безопасности. Был другой культурный бэкграунд. Именно поэтому автомобили, самолеты и прочие изобретения быстро стали частью повседневной жизни. Если же сегодня инженеры выйдут с какой-нибудь инновационной концепцией (например, что есть волшебный телепорт, который пассажиров возит путем трансклюкации), то эта разработка будет десятки лет «ползти» до стадии массового применения.
Требование 100-процентной безопасности тормозит развитие генной и клеточной терапии. Но «конюшня» уже открыта, и из нее выбежали разные «лошади». Уже сейчас FDA посматривает не только в сторону полной безопасности, но и в сторону прогресса. За последние 2–3 года было сделано несколько революционных шагов. В частности, одобрено использование трансгенных свиней для пересадки органов, употребление мяса модифицированных животных, растений и грибов в пищу, а также целый ряд генных и клеточных технологий для отдельных заболеваний. В течении 10–15 лет в генной и клеточной терапии произойдут серьезные перемены. Будет очень интересно, но дорого!
Источник knife.media