Ученые скомбинировали стволовые клетки с искусственной хромосомой для лечения мышечной дистрофии

Исследователи сообщили о применении генетически модифицированных стволовых клеток для формирования новых мышечных волокон и улучшения мышечной функции в мышиной модели мышечной дистрофии Дюшенна (МДД)

Команда из Италии, руководимая учеными из Milan’s San Raffaele Scientific Institute, вначале изолировала из кровеносных сосудов стволовые клетки, именуемые мезоангиобластами, у mdx-мышей с отсутствующим мышиным геном дистрофина. Затем генетический дефект был скорректирован с использованием человеческой искусственной хромосомы (human artificial chromosome — HAC), содержащей полноразмерный ген человеческого дистрофина (DYS-HAC), после чего содержащие DYS-HAC мезоангиобласты были введены подвергшимся иммуносуппрессии животным.

Было установлено, что трансплантированные клетки размножились и дифференцировались в мышечные клетки, и экспрессировали человеческий ген дистрофина. В результате в последующие несколько месяцев животные продемонстрировали как морфологические, так и функциональные улучшения. Эти результаты были опубликованы Giulio Gossu, M.D. и Francesco Saverio Tedesco, M.D. с коллегами в журнале Science Translational Medicine в статье “Stem Cell-Mediated Transfer of a Human Artificial Chromosome Ameliorates Muscular Dystrophy.”

Генотерапевтические подходы в лечении МДД сложны для осуществления, поскольку ген дистрофина слишком велик, чтобы быть упакованным в вирусный вектор для доставки. Поэтому основное развитие получили платформы, основанные на мини- и микродистрофине, а также методика пропуска экзонов

Примененная исследователями из San Rafaelle стратегия построена на двух технологиях, разработанных Dr. Gossu и его командой. Во-первых, в последнее время исследователи сообщали об изоляции и описании связанных с кровеносными сосудами стволовых клеток — мезоангиобластов, и продемонстрировали, что эти клетки могут дифференцироваться в несколько типов стволовых клеток мезодермы в скелетных мышцах.

Важно, что будучи введенными в кровоток, мезоангиобласты могут проходить через стенки кровеносных сосудов и участвовать в регенерации скелетных мышц. Как утверждают ученые, ранее было показано, что эти клетки способны даже улучшать симптомы мышечной дистрофии в собачьей модели заболевания. В действительности, донорские (HLA)-совместимые мезоангиобласты были размножены в условиях клинического класса и в настоящее время вводятся МДД пациентам в клиническом исследовании фазы I/II при институте (San Rafaelle)

ЧИТАЙТЕ ТАК ЖЕ:  Первая в стране! Телеведущая на инвалидной коляске рассказала о пути на экран

Вторая технология основана на использовании HAC, в частности, ученые разрабатывают HAC-вектор, содержащий полноразмерный человеческий ген дистрофина. Предварительные исследования показали, что DYS-HAC конструкция способна корректировать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), выделенные у пациентов с МДД

Теперь команда Dr. Gossu скомбинировала обе платформы для развития разработанной клеточной методики для лечения МДД. В первой серии экспериментов in vivo они изолировали мезоангиобласты у mdx-мышей, размножили их и модифицировали с помощью содержащей дистрофин HAC. HAC дополнительно были снабжены EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein — зеленый флуоресцентный белок – прим. Garry) маркером для облегчения визуализации и перенесены с белком MyoD (белок, играющий ключевую роль в регуляции мышечной дифференциации — прим. Garry), дабы способствовать их дифференциации в скелетные мышцы после трансплантации. Как отмечают авторы, трансдукция с MyoD также устраняет вариабельность спонтанной миогенной активности, наблюдаемой среди различных популяций мезоангиобластов, не подавляя при этом пролиферацию и миграцию клеток

Полученные «сконструированные» мезоангиобласты с геном дистрофина были внутримышечно инъецированы 4-месячным SCID/mdx мышам (SCID — иммунодефицит — прим. Garry) Томографическое исследование показало, что в инъецированных мышцах DYS-HAC-скорректированные мезоангиобласты широко распространены, а анализ RT-PCR обработанных мышей продемонстрировал экспрессию мышечно-специфического человеческого дистрофина

Иммуногистохимический и вестерн-блот анализы трасплантированной ткани подтвердили реконструкцию дистрофин-протеинового комплекса. Гистологические и биохимические анализы инъецированных мезоангиобластами мышц показали улучшение морфологических признаков дистрофического фенотипа, при этом уменьшилась инфильтрация мышц мононуклеарными клетками, и снизилась выраженность воспалительных факторов.

Примечательно, добавляют авторы, что трансплантированные мышцы производили 25% от количества дистрофина, производимого мышцами здоровых контрольных мышей, а измерение поперечного сечения скелетных мышц обработанных мышей в сравнении с необработанными SCID/mdx и SCID контрольными мышами показало частичную нормализацию у обработанных дистрофических животных

Ученые изучили DYS-HAC-скорректированные mdx мезоангиобласты с точки зрения долгосрочной стабильности DYS-HAC вектора и правильности экспрессии дистрофина in vitro и in vivo. Как FISH, так и PCR анализ подтвердили, что HAC вектор не интегрировался в геном хозяина и содержал корректные серии последовательностей гена человеческого дистрофина после более чем 30 делений in vitro и после 8 месяцев in vivo. RT-PCR показал корректную ткане-специфическую экспрессию гена человеческого дистрофина

ЧИТАЙТЕ ТАК ЖЕ:  «Эврисди» одобрен в Европе против СМА для новорожденных

Поскольку мезоангиобласты имеют способность проходить через стенки сосудов после их внутриартериального введения, исследователи инъецировали MyoD-экспрессирующие DYS-HAC–скорректированные mdx мезоангиобласты в бедренную артерию SCID/mdx мышей. Некоторое количество клеток были обнаружимы в миофибриллах уже в первые 12 часов, а по прошествии 36 часов имелись четкие свидетельства того, что трансплантированные клетки были равномерно распределены в мышцах. Три недели спустя кластеры дистрофин- и EGFP-положительных волокон были явными, а специфические для скелетных мышц транскрипт дистрофина и сам дистрофин обнаруживались примерно на уровне 18% от уровней у контрольных животных

У обработанных SCID/mdx мышей дополнительно отмечалось ослабление интенсивности гистологических изменений в скелетных мышцах. «Эти результаты демонстрируют способность скорректированных mdx мезоангиобластов активно участвовать в мышечной регенерации, проникая через стенки сосудов после внутриартериальной инъекции» — пишут авторы

Чтобы оценить, сопровождались ли фенотипические изменения мышц функциональными изменениями в результате терапии DYS-HAC-скорретированными mdx мезоангиобластами, исследователи измеряли моторные возможности, хрупкость миофибрилл и удельное усилие у обработанных и необработанных SCID/mdx животных. Обнадеживающим было то, что обработанные мыши как после внутримышечных, так и после внутриартериалных инъекций показали существенное улучшение мышечной силы и моторной способности по сравнению с контрольными SCID/mdx мышами, и этот положительный эффект оставался явным в течение нескольких месяцев.

Более того, мышечные волокна обработанных животных в гораздо меньшей степени окрашивались красителем Эванса голубого (Evans blue dye — EBD). ”EGFP-положительные волокна всегда были неокрашенными EBD, показывая, что экспрессия дистрофина из DYS-HAC вектора предотвращает хрупкость мембран и сопутствующую проницаемость этого красителя» — констатируют иcследователи

В завершение, а также для проверки терапевтической эффективности в более тяжелой дистрофической модели, исследователи трансплантировали скорректированные mdx мезоангиобласты Sgca-null (с отсутствием гена альфа-саркогликана — прим. Garry) мышам с подавленным иммунитетом, у которых с возрастом развивается прогрессирующая мышечная дистрофия и некроз мышц. Эти животные после обработки продемонстрировали схожее улучшение моторной способности и сниженное поглощение красителя EBD.

ЧИТАЙТЕ ТАК ЖЕ:  По прогнозам врачей он мог не дожить и до 20 лет. История Андрея Шидловича со спинальной мышечной атрофией

Общие результаты «предоставляют доказательства для эффективной клеточно-генной заместительной терапии с использованием HAC у дистрофических мышей» — заключают ученые. «Трансплантация SCID/mdx мышам скорректированных mdx мезоангиобластов снижает хрупкость миофибрилл и усиливает переносимость физической нагрузки более чем на 50%. Внутримышечная трансплантация приводит к тому, что около 10% миофибрилл становятся дистрофин-положительными, что в свою очередь приводит к синтезу дистрофина на уровне 20% от синтезируемого у SCID-мышей дикого типа, что вероятно может отражать повышенный синтез дистрофина в ядрах донорских клеток»

Исследователи отмечают, что при внутриартериальном введении аналогичной по эффективности дозой является инъекция 106 клеток. В совокупности все эти данные согласуются с сообщениями, показывающими, что синтез дистрофина на уровне примерно 30% от нормы предотвращает мышечную дистрофию как у мышей, так и у людей.

Исследователи обращают внимание, что хотя эти исследования проводились на мышах с подавленным иммунитетом, в клинических условиях иммуносуппрессия может и не потребоваться, особенно если новое поколение разработанных DYS-HAC векторов не будет содержать каких либо иммуногенных трансгенов, таких как EGFP. Другими преимуществами разработанного подхода использования мезоангиобластов являются его потенциальная применимость для всех пациентов с МДД независимо от типа мутации; наличие полноразмерного локуса дистрофинового гена, и, следовательно, осуществление корректной экспрессии различных его транскриптов; улучшенная безопасность вследствие эписомальной природы HAC, которая не интегрируется в хромосомы клетки-хозяина

Авторы признают, что существуют некоторые как технические, так и регуляторные сложности, которые надо будет преодолеть до того, как это направление сможет дойти до клинического применения. В частности, человеческие мезоангиобласты потребуют дополнительных шагов по расширению их пролиферативной способности, а также их гарантированному избирательному выживанию после трансфекции HAC. С этой целью, говорят ученые, они разрабатывают платформу для создаваемых мезоангиобластов МДД пациентов, содержащую подлежащие удалению лентивирусные вектора, экспрессирующие «бессмертные» гены

genengnews.com

Источник miopatia.ru

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *